熒光壽命的實(shí)際測量
化學(xué)先生 / 2019-08-27
熒光是分子吸收能量后，其基態(tài)電子被徽發(fā)到單線徽發(fā)態(tài)后，由第徽發(fā)單線態(tài)同到基志時所發(fā)生的，麗黃光壽命是指分子在徽發(fā)單線態(tài)所平均停留的時間。費(fèi)光物質(zhì)的熒光壽命不僅寫自的結(jié)構(gòu)面且與其所處微環(huán)境的提性、黏度等條件有關(guān)，因此通過熒光壽命測定可以直接了解所研究體系發(fā)生的變化。費(fèi)光現(xiàn)象多發(fā)生在納秒級，這正好是分子運(yùn)動所發(fā)生的時間尺度，因此利用交光技術(shù)可以“看”到許多復(fù)雜的分子間作用過程，例如超分子體系中分子同的聚集現(xiàn)象、固液界面上吸附志高分子的構(gòu)象重排、蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)的變化等。
除了真接應(yīng)用之外，黃光壽命測定還是其他時間分辨熒光技術(shù)的基礎(chǔ)。例如基于熒光壽俞測定的熒光榨天技術(shù)可以研究辯滅劑與費(fèi)光標(biāo)記物或探針相互靠近的難易，從而對所研究體系中探針成標(biāo)記物所處微環(huán)境的性質(zhì)做出判斷。基于熒光壽命測定的時間分辨熒光光譜，可以用來研究激發(fā)態(tài)發(fā)生的分子內(nèi)或分子間作用，以及作用發(fā)生的快慢。另外，非輻射能量轉(zhuǎn)移、時間分辨熒光各向異性等主要熒光技術(shù)都離不開熒光壽命測定。
熒光壽命測定的現(xiàn)代方法主要有三種，即時間相關(guān)單光子記數(shù)法(time correlated sin-gle photon counting. TCSPC)，相調(diào)制法(phase modulation methods)和頻閃技術(shù)(strobetechniques)。早期人們也曾通過測定熒光物種在溶液中的熒光偏振(P)、溶液黏度(η)以及估算熒光物種的分子體積(Vo), 再根據(jù)Perrin方程來計(jì)算熒光壽命。
測量熒光衰減過程， 按定義可以設(shè)想一個激發(fā)脈沖，繼而自然的衰減過程，如圖3-13 所示。圖中左邊的矩形代表光激發(fā)脈沖，它引起了N個激發(fā)態(tài)發(fā)色團(tuán)，產(chǎn)生初始為I的熒光強(qiáng)度:隨后星指數(shù)形式衰減，在I/e 處的時間即τo值。如果用對數(shù)作圖，從其斜率可算出平均壽命，
但是，僅用一次激發(fā)脈沖，然后測量整個衰減過程實(shí)際上是困難的，因?yàn)檫@樣對檢出系統(tǒng)有很高的要求和亞納秒的響應(yīng)時間，為克服這個困難，采用了多次激發(fā)樣品的單光子計(jì)數(shù)法，測量熒光衰減過程及平均壽命。理論上已經(jīng)證明，多次激發(fā)建立起來的衰減過程與一次激發(fā)引起的衰減過程結(jié)果是一樣的。
單光子計(jì)數(shù)法的基礎(chǔ)是把 上述過程變成觀察一個光子、-個光子的發(fā)射過程，利用每一次激發(fā)，只觀察從激發(fā)開始的時間到第一個發(fā)射出來的光子到達(dá)檢出器的時間間隔，觀察在不同時間，熒光光子出現(xiàn)的概率。例如，第一次激發(fā)，在10ns檢出到光子:第二次激發(fā)，在20ns檢出到光子:第三次激發(fā)，在100ns檢出到光子:第四次激發(fā)，在40ns檢出到光子等。只要激發(fā)次數(shù)足夠多，統(tǒng)計(jì)結(jié)果就會得到如圖3-14的指數(shù)曲線。曲線表示了不同時間熒光光子出現(xiàn)的情況，其中在20ns處最多。這就是熒光光子發(fā)射的概率分布。隨著激發(fā)次數(shù)愈多，其統(tǒng)計(jì)結(jié)果與一次激發(fā)形成無數(shù)激發(fā)態(tài)， 隨后發(fā)射所形成的熒光強(qiáng)度衰減過程息接近，直至相同。
得到的結(jié)果用計(jì)算機(jī)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，用單指數(shù)或雙指數(shù)擬合，得到τ。
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