流動(dòng)相的選擇
抖化學(xué) / 2022-11-07
流動(dòng)相的選擇色譜分離中對(duì)流動(dòng)相的選擇，按理想應(yīng)僅由所涉及的分離來決定。然而，檢測器和柱本身對(duì)流動(dòng)相的選擇有所限制。通常，移動(dòng)絲檢測器所加的限制最少。只需所用的溶劑具有合理的揮發(fā)性。折光儀檢測器在等強(qiáng)度展開法中不限制對(duì)流動(dòng)相的選擇，但如前所述，不能有效地用于梯度洗脫。UV 檢測器不能用于具有明顯的UV發(fā)色團(tuán)的溶劑，甚至在UV區(qū)只有微小吸收的溶劑，在梯度洗脫時(shí)經(jīng)常導(dǎo)致明顯的基線階梯。
采用UV檢測器，大多數(shù)極性類似的混合物質(zhì)的分離，可由使用仔細(xì)選定的溶劑混合液的等強(qiáng)度展開來完成。這類溶劑混合液的組成，主要是庚烷和氯仿，再加上1~5%V/V的一種或多種溶劑如乙酸乙酯，四氫呋喃，丙醇或甲醇。對(duì)未知樣品尋找溶
劑的探索方法，已由Rabel作了描述「3]。
這一系統(tǒng)只利用對(duì)UV檢測器是透明的溶劑。Rabel發(fā)展了一種適用于UV檢測的逐漸增量的梯度系統(tǒng)，這種檢測形式現(xiàn)正普遍使用。用較低靈敏度的UV調(diào)節(jié)位置(非線性的或X64)進(jìn)行初始的檢測工作，以消除由溶劑系統(tǒng)的改變所引起的基線漂移。更靈敏的調(diào)節(jié)可用作定量工作，因?yàn)檫x定的溶劑混合液，可能不再引起梯度或基線的這樣陡的變化。選定的溶劑系列和溶劑混合液如下。
1.庚烷
2.庚烷含5%氯仿
3.庚烷含2%乙酸乙酯
4.庚烷含1%2-丙醇
5.庚烷含5% 2-丙醇
6.庚烷含10%2-丙醇
以上溶劑由手工操作，關(guān)掉泵及將管子轉(zhuǎn)換到下一個(gè)溶劑瓶，按順序使用。在轉(zhuǎn)換中，注意避免空氣泡進(jìn)入系統(tǒng)。在完成初步的篩選之后，梯度的最終形式就易于調(diào)節(jié)了。當(dāng)很多峰擁擠在一起時(shí)，梯度的斜率應(yīng)予減小，這可由選擇不同的溶劑，或延
長改變?nèi)軇┑臅r(shí)間，或增大混合室的體積來完成。何處出現(xiàn)了峰的分離距離過大，就需要相反的步驟。應(yīng)用此步驟分離一個(gè)配制的農(nóng)藥樣品的例子，示于圖12- 2。選擇流動(dòng)相的另一個(gè)方法，是利用得自混合物薄層分離的資料。
如果已經(jīng)由薄層色譜法完成了分離，則相似的溶劑對(duì)于硅膠柱大多是有效的。但因薄層板的展開包含有梯度洗脫的形式，所以，用于硅膠柱的溶劑極性，必需稍予減低。用于非極性鍵合相填充柱的溶劑，通常為甲醇和水或乙腈和水的混合液。溶劑組成的范圍在含水5%到50%之間。準(zhǔn)確的溶劑混合液，可由逐漸地提高水含量的實(shí)驗(yàn)來確定，直到實(shí)現(xiàn)所希望的分離。
為了最有效地使用吸附色譜法，必須具有包括全部極性范圍從庚烷到水的一.系列溶劑。而且，為了最有效的梯度洗脫的展開，也必須采用系列中極性差別很小的許多溶劑，而不使用兩種或三種極性差別很大的溶劑混合的方法進(jìn)行分離。因?yàn)楫?dāng)流動(dòng)相的組成由加入極性更強(qiáng)的溶劑而改變時(shí)，色譜展開的條件以兩種方式發(fā)生改變。首先，吸附劑失活，導(dǎo)致溶質(zhì)與固定相之間的保留分子力減低;其次，增大的溶劑極性導(dǎo)致溶質(zhì)與流動(dòng)相之間的洗脫分子力增大。兩種作用均增大所有溶質(zhì)的遷移速度，但吸附劑的失活是決定溶質(zhì)的保留作用的最大因數(shù)。由此可見，如果溶劑的極性變化很大，就將有一個(gè)大的失活步驟，共極性處于原始的極性溶劑的極性與新的極性溶劑的極性之間的所有溶質(zhì)，將從吸附劑上被頂替下來，一齊洗脫或分辨極 差。這種頂替效應(yīng)已由Scott和Kucera做了一些詳細(xì)的討論[4]，得出的結(jié)論是吸附劑的失活必須控制，使以細(xì)小的步伐進(jìn)行，以防止引起頂替效應(yīng)而損害分辨率。這意味著在梯度洗脫中，從一種溶劑到另一種溶劑的極性變化，必須保持在很小的范圍內(nèi)。如前所述，為使一個(gè)梯度洗脫程序，對(duì)于含有任何種類的以及一。 切極性的物質(zhì)的任何溶質(zhì)混合物均有效，所采用的溶劑，必須包括從非極性溶劑庚烷到高度極性的溶劑水的全部極性范圍。而且，如果溶劑間的極性變化保持很小，以減小頂替效應(yīng)，則必須采用很多種溶劑，每種相繼的溶劑比其前一種的極性稍大。Scott和 Kucera發(fā)現(xiàn)，可以采用12種仔細(xì)選出的溶劑，當(dāng)用于漸增的梯度洗脫時(shí)它們有效地包括了庚烷和水之間的極性范圍。他們?cè)谠颊撐闹薪o出了這些溶劑的詳細(xì)情況以及選擇它們的理由。然而，他們也發(fā)現(xiàn)，為了在那些中等極性的溶劑之間，提供所需的細(xì)小的極性增量，就不得不選擇許多具有強(qiáng)烈UV發(fā)色團(tuán)的溶劑。因此，他們的溶劑系
統(tǒng)不能使用UV檢測器。作者們也得出結(jié)論，只用在光譜的UV區(qū)透明的溶劑，是不能包括庚烷和水之間的、以細(xì)小的極性增加的整個(gè)極性范圍。但是，選擇的所有溶劑都是揮發(fā)的。因此，該溶劑系列能使用移動(dòng)絲檢測器。實(shí)際上移動(dòng)絲檢測器是現(xiàn)時(shí)可
利用作多溶劑的漸增梯度洗脫的唯檢測器。
為在色譜分析中利用溶劑系列，需要一種特殊形式的設(shè)備[5]。此設(shè)備必須 包括一個(gè)多重貯槽系統(tǒng)，-一個(gè)多 口選擇閥門!和一個(gè)合適的程序裝置。位于多口閥和泵之間的混合容器，必須具有這樣的形式，使稀釋體積如有需要便能在每次操作之間迅速改變，以獲得必須的溶劑濃度分布。最后，柱和檢測器的結(jié)構(gòu)及操作，必須使柱外效應(yīng)所導(dǎo)致的譜帶擴(kuò)展最小。此設(shè)備的方塊圖示于圖12-3。在此不提供此設(shè)備的詳細(xì)描述，因?yàn)樵颊撐闹幸?/span>有詳細(xì)的描述，而且當(dāng)前市場上可買到整套的設(shè)備。但溶劑程序器是新穎的形式，將簡單地描述一下。
Anasol 20程序器是全電子化的定時(shí)儀器，它在一個(gè)集成線路存貯器中貯存有16個(gè)數(shù)，各有2位數(shù)字。一個(gè)20孔的旋轉(zhuǎn)閥，對(duì)最初的16個(gè)位置自動(dòng)控制-段精確的時(shí)間。此時(shí)間等于已經(jīng)放置在貯存器中的相應(yīng)數(shù)字。旋轉(zhuǎn)閥的最后4個(gè)位置，用來在隨后的樣品分析之前，以適當(dāng)?shù)娜軇?duì)色譜柱進(jìn)行重新調(diào)整。這幾個(gè)位置由安裝在前方面板上的開關(guān)來定時(shí)。貯存器的內(nèi)容，經(jīng)過的時(shí)間和閥的位置都在一直顯示著?？晒?yīng)一個(gè)系列關(guān)閉閥門，這可在需要時(shí)自動(dòng)或手動(dòng)控制溶劑。Anasol20程序器也包含有用
作自動(dòng)取樣注射，事件標(biāo)示和程序的再循環(huán)等備件。
對(duì)給定的柱子和流動(dòng)相，采用等強(qiáng)度的展開法，由操作者選擇的唯一變量是柱的流速，它調(diào)整從柱 子獲得的效率和分析時(shí)間。在梯度洗脫展開的情況下，也需要選擇所用溶劑的濃度輪廓，以提供最佳分離。如果使用漸增梯度洗脫法，每種溶劑的時(shí)
間間隔，必須與混合容器的適宜體積-起挑選。對(duì)于250和500毫米長，6.35毫米外徑和4 .6毫米內(nèi)徑，填充了5或10微米硅膠的柱子，最佳操作條件已由Scott和Kucera所確定61。這些作者們考慮了兩組最佳條件，組為 了提供最大的分辨率，另一組提供。最小的分析時(shí)間。這些條件是:
對(duì)于最大的分辨率:
Qt
------ =0.70
V
對(duì)于最小的分析時(shí)間:
Qt
------=0.85
V
式中Q是柱的流速，t是每個(gè)溶劑的時(shí)間間隔，V是混合容器的體積，此外，對(duì)于最大分辨率和最小分析時(shí)間二者都是Qt=2.5倍柱的死體積。
最后的條件確保每個(gè)溶劑用來展開色譜圖都超過2.50的k'范圍。
當(dāng)采用250毫米長，4.6毫米內(nèi)徑，填充以10微米硅膠和具有3.0毫升死體積的柱子時(shí)，考察對(duì)于最小分析時(shí)間的梯度展開的條件。首先必須選 擇流動(dòng)相的流速，此值僅由所需的 效率所決定。假設(shè)選定的流速是1毫升/分，則Qt=2.5倍柱的死體積，1×t=2.5×3,或t=7.5分。 現(xiàn)因程序器有1分的識(shí)別時(shí)間，于是每種溶劑的間期t將是8分鐘。因此
1×8
-------=0.85
V
或
8
V=----------=9.4毫升
0.85
因此混合容器的體積應(yīng)調(diào)定為9.4毫升。
對(duì)于柱流速為2毫升/分時(shí)可計(jì)算如下
t=4分
t=9.4毫升 對(duì)于最小分析時(shí)間
以及
t=4分
V-11.4毫升
對(duì)于最大分辨率
漸增梯度洗脫法，超過其它梯度系統(tǒng)，優(yōu)點(diǎn)在于操作條件只取決于所采用柱子的性質(zhì)，而與所要分 離樣品的性質(zhì)無關(guān)。因此，當(dāng)選定柱子之后，操作條件則可按以前描述的方式來確定。于是這些條件就是不變的，并適用于任何提交分離的樣品。由此
可見，不管樣品的復(fù)雜性，或其組成部分的極性范圍，都能夠立即得到分離。使用漸增梯度洗脫以分離這些多種多樣的混合物，如蜂蠟、口紅、組織中的類脂化合物以及保護(hù)肽類的例子，示于圖12-4、12-5、 12-6和12-7。 可以看到，根據(jù)所用柱子的長度，在45分或90分鐘內(nèi)，可立即得到樣品的色譜圖，說明混合物的復(fù)雜性及其組分的極性范圍。
通常，一個(gè)完全未知的混合物，首先應(yīng)以梯度洗脫步驟進(jìn)行觀察，以獲得樣品組分的極性范圍的確切指示。如果不這樣做，存在的高度極性物質(zhì)可能永遠(yuǎn)也不能被洗脫和檢出。根據(jù)同樣理由，如果可能，就應(yīng)使用移動(dòng)絲檢測器，以使存在的所有物質(zhì)均被指出，而不單只指出那些對(duì)UV光譜有吸收的物質(zhì)。如果樣品的性質(zhì)已經(jīng)確定，同時(shí)僅有一種或有限數(shù)目的溶質(zhì)是感興趣的(在控制分析中常為這種情況)，則等強(qiáng)度方法的展開是合適的。在這種情況下，極性低于欲測組分的物質(zhì)可被迅速洗脫，不
經(jīng)分辨地接近于死體積，而那些高極性的物質(zhì)則可永久地保留在柱中。以這- .方式使用等強(qiáng)度展開，可實(shí)行快速的例行分析，但應(yīng)注意，任何未洗脫的高極性物質(zhì)均在柱上積累。必須使用高極性溶劑定期地除去這些物質(zhì)，隨后用一個(gè)合適的溶劑序列，使此柱再生，以達(dá)到相當(dāng)于用作等強(qiáng)度展開的溶劑的活性[5]。
.jpg "溶劑號(hào)數(shù)時(shí)間")
.jpg "用作淅增梯度洗脫的設(shè)備的方塊圖")
.jpg "組織中類脂化合物的色譜圖")
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