薄層層析法的操作方法
實(shí)驗(yàn)室k / 2019-07-16
(一)鋪板 薄層層析法是將吸附劑或擔(dān)體均勻地涂鋪在板上成為厚度一致的薄層，這個(gè)過(guò)程稱為鋪板或制板。制成以后的板稱薄層板或薄板。要鋪好薄板，首先對(duì)板的要求是平整、清潔。板一般選用普通玻璃即可。玻璃板的大小，根據(jù)操作需要而定。有6×20厘米，10×20厘米或正方形，也可用載玻片做微量薄層。玻璃板在使用前應(yīng)先用洗滌液浸泡，再用自來(lái)水沖洗，最后用蒸餾水洗凈后烘干備用。
常用的薄板有兩種，一種是不加粘合劑的稱軟板；另一種加粘合劑的稱硬板或稱粘合薄層板。
不加粘合劑的鋪板方法為干法鋪板。加粘合劑的鋪板方法為濕法鋪板?，F(xiàn)將兩種鋪板方法介紹如下：
1.干法鋪板 將層析用的吸附劑撒在玻璃板的一端，另取一根比玻璃板寬度要長(zhǎng)一些的玻璃棒、玻璃管或試管均可，在它的兩端比板的寬度略窄一些處包上一條橡皮膠或套上塑料管、橡皮管，其厚度即為所鋪薄層厚度。用于分離鑒定的薄層，其原度約為0.25毫米，用于分離制備用的薄層，其厚度最厚可達(dá)1毫米。接玻璃寬度在玻璃上再包幾層橡皮膠做為涂鋪時(shí)的固定邊，以防止滑動(dòng)使邊緣不齊。然后從撒上吸附劑的一端，用力均勻向前推擠，推移時(shí)不宜太快，也不能中途停頓，否則鋪出的薄層不均勻，影響層析效果。如圖14-10。
干法鋪板方法簡(jiǎn)單，但只適用于鋪氧化鋁和硅膠，其它如聚酰胺等就不易鋪成。另外由于不加粘合劑，所以薄層很不堅(jiān)固，易松動(dòng)離散，展開(kāi)時(shí)只能用近水平展開(kāi)，顯色時(shí)易吹散，因此在操作時(shí)應(yīng)事常小心、細(xì)致。
2.濕法鋪板 在吸附劑中加入粘合劑并用適當(dāng)溶劑溶解粘合劑后與吸附劑調(diào)成糊狀進(jìn)行鋪板這種操作稱為濕法鋪板，干燥后的板即成硬板。粘合劑種類(lèi)很多，目前常用的粘合劑有煅石音(G)和羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)。用煅石膏制成的硬板，機(jī)械性能差，易脫落，但能耐受腐蝕性試劑如濃硫酸等的作用。而羧甲基纖維素鈉制成的硬板，機(jī)械性能強(qiáng)，可用鉛筆寫(xiě)字或標(biāo)記，但不宜在強(qiáng)腐蝕性試劑存在下加熱。
鋪板方法
(1)傾注法 將按比例調(diào)制的糊狀吸附劑傾注于玻璃板上，在較為水平的工作臺(tái)上輕輕敲勻，使表面平坦光滑，放置在工作臺(tái)上由空氣干燥后活化。
(2)刮板法 可用二塊3毫米厚的玻璃板中間夾一塊2毫米的玻璃板(鋪板用)，把已調(diào)好的糊狀吸附劑傾注在中間的一塊玻璃板上，再用一塊邊緣平整的玻片或塑料板，將吸附劑從一端刮向另一端，然后在空氣中干燥后活化。也可用與干法鋪板一樣用一根玻棒，兩端用橡皮管固定厚度，再用一根塑料管固定板的邊緣，由一端推向另一端的鋪板方法。圖14-11。
現(xiàn)在市場(chǎng)上有涂鋪器和已制成的硬板以商品出售，也可自制涂鋪器，用涂鋪器鋪出的薄層厚度均勻一致。
(二)介紹幾種硬板的制備
1.以煅石膏為粘合劑
(1)硅膠煅石膏(硅膠G)硬板 含煅石膏13％左右。稱一定量的硅膠G，加水一倍至二倍，滴加幾滴乙醇以防止氣泡，在研缽中調(diào)成均勻的糊狀(不能有結(jié)塊)，立即鋪板，時(shí)間太長(zhǎng)易凝固。空氣中干燥后于105℃活化半小時(shí)，置干燥器中備用。
(2)氧化鋁煅石膏(氧化鋁G)硬板 含煅石膏5％左右。稱一定量市售氧化鋁G，加一倍水，滴加幾滴乙醇以防止產(chǎn)生氣泡，在研缽中調(diào)成糊狀，鋪板，在空氣中干燥后于150～160℃烘4小時(shí)，活化后置干燥器中備用。
2.以羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)為粘合劑
(1)硅膠CMC-Na硬板 稱1克CMC-Na溶解于100毫升水中，加熱煮沸，不斷攪拌直到完全溶解。取180～200目層析用硅膠55克，加1％CMC-Na落液100毫升，調(diào)成均勻糊狀、鋪板，晾干后于110℃活化半小時(shí)，置干燥器中備用。
(2)氧化鋁CMC-Na硬板 稱取200目層析用氧化鋁60～80克，加1％CMC-Na溶液100毫升，調(diào)成均勻糊狀，鋪板，晾干后于110℃活化半小時(shí)置干燥器中備用。
對(duì)已活化的硬板，應(yīng)對(duì)光觀察厚度均勻，表畫(huà)光潔平整，沒(méi)有粗粒、氣泡和裂紋。
(三)吸附薄層層析中氧化鋁和硅膠的活度測(cè)定法 取0.02毫升染料溶液(偶氮苯30毫克和對(duì)甲氧基偶氮苯、蘇丹黃、蘇丹紅、對(duì)氨基偶氮苯各20毫克，溶于50毫升四氯化碳中)，滴加于氧化鋁或硅膠薄層一端上，用四氯化碳展開(kāi)后，比較其Rf值。活度定級(jí)表如下：
氧化鋁、硅膠活度定級(jí)表
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Ⅱ |
Ⅱ |
Ⅲ |
Ⅲ |
Ⅳ |
Ⅳ |
Ⅴ |
Ⅴ |
| 染料 |
氧化鋁 |
硅膠 |
氧化鋁 |
硅膠 |
氧化鋁 |
硅膠 |
氧化鋁 |
硅膠 |
|
偶氮苯
對(duì)甲氧基氮苯
蘇丹黃
蘇丹紅
對(duì)氨基偶氮苯
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0.59
0.16
0.01
0.00
0.00
|
0.16
0.28
0.18
0.11
0.04
|
0.74
0.49
0.25
0.10
0.03
|
0.70
0.43
0.30
0.13
0.07
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0.85
0.69
0.57
0.33
0.08
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0.83
0.67
0.53
0.40
0.20
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0.95
0.89
0.78
0.56
0.19
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0.86
0.79
0.64
0.50
0.20
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(四)點(diǎn)樣 點(diǎn)樣方法與紙層析法相同，原點(diǎn)直徑不超過(guò)2～3毫米，為了避免在空氣中吸濕而降低活性，一般點(diǎn)樣時(shí)間不超過(guò)10分鐘為宜，點(diǎn)樣后待溶劑揮發(fā)，即可放入層析缸內(nèi)展開(kāi)。如用于分離制備，則應(yīng)連續(xù)滴加樣品溶液，使在原點(diǎn)成為一條樣品線。應(yīng)注意滴加樣品的量要均勻，否則影響分離效果，待溶劑揮發(fā)后，置入層析缸內(nèi)進(jìn)行展開(kāi)。
(五)展開(kāi) 薄層層析的展開(kāi)方式與紙層析基本相同，須在密閉容器內(nèi)進(jìn)行，并根據(jù)所用層析板的大小選用不同的層析缸，軟板的展開(kāi)只能用近水平方式展開(kāi)(圖14-12)。硬板可采用上行展開(kāi)法、下行展開(kāi)法、雙向展開(kāi)法等，一般采用上行展開(kāi)法。
操作時(shí)先將容器密閉，待展開(kāi)劑蒸氣飽和，放進(jìn)薄板，一般展開(kāi)到薄板的為3/4左右，取出，在前沿做好標(biāo)記，軟板在空氣中晾干，硬板可用電熱吹風(fēng)或烘箱中烘干。
在薄層層析中，當(dāng)使用混合溶劑做展開(kāi)劑展開(kāi)時(shí)，有時(shí)會(huì)出現(xiàn)同一組分在薄層的中部比在薄層的邊緣兩邊移動(dòng)得慢的現(xiàn)象。即同一組分在薄板中部比兩邊的Rf值小。這種現(xiàn)象稱為“邊緣現(xiàn)象”或稱“邊緣效應(yīng)”如圖14-13所示。產(chǎn)生邊緣效應(yīng)的原因，是由于容器中展開(kāi)劑蒸氣沒(méi)有達(dá)到飽和，因而在展開(kāi)過(guò)程中，極性較弱與沸點(diǎn)較低的溶劑在薄層的兩邊較易揮發(fā)。使溶劑組成與薄層中部不同，結(jié)果使兩邊邊緣處含極性較大的溶劑成份多。所以斑點(diǎn)的Rf值大，而中部斑點(diǎn)的Rf值小。消除邊緣效應(yīng)的辦法，是要使層析缸內(nèi)展開(kāi)劑蒸氣達(dá)到飽和，為此可以在缸的內(nèi)壁貼上浸濕了展開(kāi)劑的濾紙，以加速溶劑蒸氣在缸內(nèi)飽和速變。
(六)顯色 展開(kāi)結(jié)束后斑點(diǎn)檢查方法也和紙層析相同，先在紫外燈下觀察有無(wú)熒光斑點(diǎn)，如為硬板可用鉛筆劃出斑點(diǎn)位置并記錄熒光顏色。軟板可用小針劃痕并做記錄。如無(wú)熒光可選擇合適的顯色劑噴酒。軟板噴酒顯色劑時(shí)應(yīng)趁展開(kāi)劑尚未揮發(fā)呈潮濕狀態(tài)即行噴酒，否則容易吹散。硬板則可待溶劑揮發(fā)后噴酒顯色，有的可用具有強(qiáng)腐蝕性顯色劑顯色。有時(shí)可放在碘蒸氣飽和的密閉容器中顯色。
對(duì)于軟板顯色除用上述方法外，尚可采用。
1.壓板法 薄層展開(kāi)后取出，另取一塊清潔、平整的玻璃板，上面涂顯色劑，當(dāng)薄板上的展開(kāi)劑尚未完全揮發(fā)時(shí)，立即用涂有顯色劑的玻片覆蓋上，并壓緊，即可顯色。
2.側(cè)吮法 薄層展開(kāi)后取出，使展開(kāi)劑完全揮發(fā)，再將薄板的另一側(cè)(與展開(kāi)方向垂直)輕輕浸入顯色液中進(jìn)行側(cè)吮顯色，當(dāng)顯色劑擴(kuò)散到全部薄板后，取出干燥，即可出現(xiàn)色斑，但要注意被檢組分不能被顯色劑展開(kāi)。否則不能使用此法顯色。
(七)定性 薄層定性常將樣品與標(biāo)準(zhǔn)品同在一張薄板上點(diǎn)樣，展開(kāi)，顯色。如果樣品組分的Rf值與標(biāo)準(zhǔn)品的Rf值相同，表示該組分與標(biāo)準(zhǔn)品為同一物質(zhì)。也就是測(cè)Rst。因薄層的Rf值的影響因素很多，如吸附劑的粒度、展開(kāi)劑的純度、薄層的厚度、展開(kāi)方式和展開(kāi)距離、層析缸中展開(kāi)劑的飽和程度、點(diǎn)樣量等等。
(八)定量
1.目視定量法 是樣品經(jīng)層析后，直接觀察斑點(diǎn)的大小，顏色深淺的定量方法，因此，此法要在同一塊板上做樣品和已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品系列，在相同條件下展開(kāi)顯色后，與已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)色斑相比較，可近似地判斷出樣品中待測(cè)組分的含量。
2.洗脫定量法 取樣品和標(biāo)準(zhǔn)品在起始線上點(diǎn)兩個(gè)原點(diǎn)，且平行展開(kāi)，顯色時(shí)將樣品用玻板遮掉，將標(biāo)準(zhǔn)品顯色。然后在相當(dāng)于標(biāo)準(zhǔn)品Rf值處，將樣品從薄板上連同吸附劑一起刮下，置離心管中，選擇適當(dāng)溶劑將該組分從吸附劑中抽取出來(lái)。離心除去吸附劑，將溶液用其它儀器分析方法測(cè)定含量。
軟板也可用捕集器吸取含有斑點(diǎn)的吸附劑(圖14-14)然后進(jìn)行提取定量。
3.薄層掃描儀定量 用一定波長(zhǎng)，一定強(qiáng)度的光束照射到分離組分的色斑上，用儀器進(jìn)行掃描，儀器用標(biāo)準(zhǔn)品校正后，即可測(cè)定色斑中組分的含量。
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.jpg "軟板樣品收集及洗脫")
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