甲烷和分子氧的活化機(jī)理
化學(xué)先生 / 2019-07-30
甲烷單加氧酶的催化反應(yīng)循環(huán)是羥基化酶MMOHox,在還原酶的作用下先從NADH接受兩個(gè)電子，變?yōu)檫€原態(tài)。然后還原態(tài)的MMOHred與分子氧作用，經(jīng)過兩種中間態(tài)0和P，脫去水后形成中間物Q，Q與底物結(jié)合，再經(jīng)過兩種過渡態(tài)形式R和T,釋放出產(chǎn)物，并重新回到氧化態(tài)的MMOH,如圖3-10所示。要證明這一反應(yīng)機(jī)理的有效性，就必須設(shè)法檢測(cè)到在催化反應(yīng)循環(huán)中，MMOH的雙鐵核中心與分子氧和反應(yīng)底物形成中間化合物。
(1)中間化合物O的形成在MMOB存在條件下，將處于還原態(tài)的羥基化酶MMOH與02迅速混合，發(fā)現(xiàn)g=16的EPR信號(hào)消失，而這一信號(hào)是二價(jià)Fe的特征，推測(cè)可能是O:與二價(jià)Fe相結(jié)合在活性點(diǎn)上的狀態(tài)。
(2)中間化合物P的形成這是一種沒有EPR信號(hào)的中間化合物。它在700nm左右有比較寬的吸收帶。拉曼光譜和Mossbauer譜的研究都表明O2分子是對(duì)稱地連接到鐵原子上，形成了過氧化物復(fù)合物。
(3) 中間化合物Q的形成化合物 P自動(dòng)轉(zhuǎn)變?yōu)橐环N黃色的中間化合物，吸收峰值= 330nm，430nm, 通過Mossbauer譜的研究，推斷化合物Q中的兩個(gè)鐵是抗磁性高自旋四價(jià)Fe(IN)原子。這是目前發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)Fe(IV)雙核鐵簇。從EXAFS和Mossbauer譜給出的分析結(jié)果推測(cè)，MMOH的中間體具有FefO2鉆石核結(jié)構(gòu)。這種結(jié)構(gòu)保證了高價(jià)態(tài)Fe(IV)- O鍵的穩(wěn)定性。
(4)中間化合物R的形成化合物Q與底物的反應(yīng)是MMO催化反應(yīng)循環(huán)中最關(guān)鍵的一步。推測(cè)是Q與底物反應(yīng)，從底物中獲得一個(gè)氫生成一個(gè)底物自由基中間體R。
(5)中間化合物T的形成在底物硝基苯存在時(shí)， 中間體Q消失后產(chǎn)生有色的產(chǎn)物硝基苯酚。用停流譜觀察硝基苯酚的產(chǎn)生過程，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)物是通過一種在325nm和395nm有吸收峰的中間體T形成的，T消失后重新產(chǎn)生氧化態(tài)的MMOH.
從圖3-10的機(jī)理模型不難看出，甲烷單加氧酶催化反應(yīng)機(jī)理的研究，可以概括為兩個(gè)部分，首先是分子氧活化，然后是底物烴的活化。在分子氧的活化過程中，中間化合物P到Q的轉(zhuǎn)化過程主要是由于分子氧的0--O鍵斷裂。Lipscomb及其同事認(rèn)為，在中間物P中O 0鍵斷裂形成Q中間體的同時(shí)，氧與體系中的質(zhì)子形成了水分子。甲烷C H鍵的活化可能存在兩種機(jī)理，即自由基機(jī)理和氧插入機(jī)理，Lipscomb等更傾向于自由基機(jī)理。他們使用手性乙烷檢測(cè)M. trichos proium OB3b的sMMO催化反應(yīng)產(chǎn)物認(rèn)為，作為自由基探針底物的這種小分子與甲烷相似，分析結(jié)果說明有自由基的形成。用相同的方法，對(duì)M.capsulatusBath菌的MMO進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，也取得了相似的結(jié)果。Lippard提出了氧插人機(jī)理，他們使用甲基異構(gòu)烷烴作為探針底物，研究了M. capsulatus Bath菌，沒有發(fā)現(xiàn)重排產(chǎn)物，只在甲基位置發(fā)生了羥基化。這種現(xiàn)象說明催化過程中并沒有自由基中間體形成。
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