凝膠色譜法的實驗選擇方法及其應用
實驗室k / 2019-07-27
實驗條件的選擇與實驗方法
1.凝膠的選擇 根據(jù)上述凝膠色譜的原理，分離方式大體上可分成兩種類型。
一類是從低分子量物質中除去高分子量物質，或者從高分子量物質中除去低分子物質。這種被分離物質之間的分配系數(shù)有著明顯的差別，稱為組別分離?？墒褂酶鞣N型號的葡聚糖凝膠，以選G-25或G-50為好。一般，從低分子量物質中除去高分子量物質選用交聯(lián)度小、孔隙較大的型號；反之，選用交聯(lián)度較大、孔隙小的型號為好。
另一類是被分離物質的分子量比較接近，分配系數(shù)介于0～1之間。這種分級分離比組別分離要求高，常用于分子量的測定。一般采用交聯(lián)度小、吸水量大的凝膠，如G-75、G-100、G-200。
2.凝膠的浸泡溶脹 將所需的干凝膠浸入相當于其吸水量10倍的洗脫劑中。例如1gG-50，加50ml(10×5ml)洗脫劑，緩緩攪拌使其分散在溶液中，防止結塊，但不能用機械攪拌器，避免顆粒破碎。浸泡時間根據(jù)交聯(lián)度而異，交聯(lián)度小的吸水量大，則需時間較長，也可加熱膨脹。所制備的凝膠勻漿不宜過稀，否則裝柱時易造成大顆粒下沉，小顆粒上浮，致使填充不均勻。
3.色譜柱的制備 在凝膠色譜中，影響分離度的柱變量中最重要的是柱長度、顆粒直徑及填充的均勻性。雖然理論上認為用足夠長的柱可以獲得不同程度的分離度，分離度隨柱長的平方根而增加，柱長加倍，分離度增加40％，但流速至少降低50％。在凝膠色譜中原來就存在著分離速度較慢的缺點，因此，凝膠色譜是很少應用長于100cm的柱。當分離K值較接近的組分時，柱長需超過1m，則可采用幾根短柱串聯(lián)。
顆粒直徑對分離度作用是顯著的，應用小順?？梢愿倪M分離度。
裝柱的方法和一般柱色譜相似，填充時不應有氣泡，填充后用同一種洗脫劑以2～3倍總體積穩(wěn)定柱長。填充均勻與否則可用0.2％藍色葡聚糖(分子量2000，溶于同一種洗脫劑中)溶液通過柱床，觀察其在柱內移動情況來判斷填充的均勻程度。
4.樣品的制備 在凝膠色譜中，由于分離對象是大分子量的物質，當樣品濃度大時，粘度也隨之增大。因此，樣品的濃度應視其粘度而定。如果樣品粘度相對于洗脫劑粘度的3～5倍時，則要損失分離度。
凝膠色譜的上樣量可比其他的色譜形式大些，如果是組別分離，上樣量可以是柱體積的25～30％；如果分離K值相近的物質，上樣量為柱體積的2～5％。
5.洗脫 在凝膠色譜中，洗脫用的溶劑應與浸泡膨脹凝膠所用的溶劑相同。如果換溶劑，凝膠的體積會發(fā)生變化從而影響分離效果。除非含有較強吸附的溶質，一般洗脫劑的用量也只需一個柱體積就夠了。洗脫用的溶劑可以是水、不同離子強度的溶液或不同pH值的緩沖液。對吸附較強的組分也有使用水與有機溶劑的混合液的，如水-甲醇、水-乙醇、水丙酮等，以降低吸附，將組分洗下。
洗出液多采用分段收集法，然后用適當?shù)姆椒ǚ治鼋M分流出和分離情況。
應用
凝膠色譜技術得到了廣泛的應用。特別是在生物化學方面解決了用一般方法不易分離的許多問題。近年來開始用于較小分子物質的分離，也取得了成功。
1.脫鹽 在分離生化樣品時，常常需要加入不同pH緩沖溶液，或者采用鹽析法，使樣品帶入各種電解質，如蛋白質溶液的脫鹽等，常常采用交聯(lián)度較大的凝膠，例G-25或Bio-P-2，即使樣品體積是柱體積的25～30％，也不損失分離度，分析速度快且蛋白質和酶不變性。
為防止脫鹽過程中由于電解質的減少引起蛋白質沉淀在柱上，使分離失效，則可在操作時先用揮發(fā)性鹽類的緩沖溶液平衡柱床，然后再加入樣品分離。
2.濃縮 利用干凝膠吸水膨脹的性質(如G-200可吸收它本身重量20倍的水分)，將它加進高分子溶液中，在凝膠膨脹時，水和低分子物質進入顆粒內部的孔隙，高分子物質被排阻在顆粒外部溶液中，從而達到分離目的。例如自海水中濃縮少量的維生素B12、分離一些受熱易變性的蛋白質等。
3.去熱源 去離子水只是除去了離子，還沒有除去熱原。熱原系多糖和蛋白質的復合物，分子量約90000。常用DEAE-A-25(二乙氨乙基-陰-25)凝膠柱來進行分離，它既具有交換陰離子的能力，又有一定的網(wǎng)孔作用，可以除去分子量小于100000的物質。該法用來除去大型輸液、注射用水或核苷酸注射液中的熱原。
4.測定分子量 凝膠色譜法常用來測定大分子物質(如蛋白質)的分子量，特別是球蛋白的分子量。它們的洗脫特性與組分分子量有關，即有一定的線性關系，可用下式表示:：
VR＝K1-K2logM
式中：K1和K2為常數(shù)，M為分子量
測定時，先用同類型不同分子量的化合物，在適當?shù)哪z上，找出洗脫體積和分子量之間的關系，繪出校正曲線，由此曲線上再求出未知樣品的分子量。
5.測定聚合物分子量的分布情況 高分子物質的分子量分布比它的平均分子量更有意義，但平均分子量容易測定，而分子量分布的測定比較困難。凝膠色譜法較簡便地解決了這個問題，其原理與方法和測定分子量相同。根據(jù)樣品的洗脫曲線分段收集流出液，可以看出一個聚合物中分子量的分布情況。此法已廣泛地用來測定右旋糖酐、聚乙烯等聚合物的分子量分布。
可以相信，隨著凝膠新類型的研究改進，在加壓情況進行工作，并與適當?shù)臋z測器和記錄器聯(lián)用，不僅可大大加快分離速度，而且可提高分離效率。
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