制備規(guī)模的高效液相色譜
抖化學(xué) / 2022-10-03
制備規(guī)模的高效液相色譜分析HPLC的目標(biāo)，是使用很少的樣品以最大的分辨率完成高速度的分離，而制備規(guī)模的HPLC的目標(biāo)就極其不同。此刻，速度并不重要，所要求的是以最好的分辨率在單位時(shí)間內(nèi)處理最大的樣品量。需要考慮的主要效應(yīng)是柱的過負(fù)荷問題。粗略地講，當(dāng)樣品負(fù)荷約為每立方厘米填充物有1毫克溶質(zhì)時(shí)，超載開始對分辨有重要的影響[1]。因此，大的制備容量要求使用大體積的柱子。例如1升的柱子應(yīng)能分離1克物質(zhì)而不喪失分辨率。在能夠容許的嚴(yán)重超載情況下，還可以用更大的樣品量。
在制備規(guī)模的LC中，顯然應(yīng)該利用無限直徑效應(yīng)。因?yàn)橹?/span>子必須有大的體積，所以要使用口徑比較寬的管子，這樣，極高的壓力就可能有危險(xiǎn)。限制壓力在例如5兆牛頓/米²(50大氣壓)可能比較適當(dāng)。為了避免從非常短粗的柱收集流出譜帶的問題，可采用長度對直徑的比率如20或更大些的柱。在這樣的條件下，一根250毫升的柱可以是口徑25毫米和長500毫米，而1000毫升的柱則可以是口徑40毫米，長800毫米。
還需要決定用多大的顆粒直徑，能夠產(chǎn)生合理的速度和效串。表2-4表明，用5兆牛頓/米²(50大氣壓)壓力降和20微米顆粒，就可能期望從650毫米的柱，洗脫時(shí)間略少于20分鐘，對于k'=4的溶質(zhì)得到5000左右的塔板數(shù)。這時(shí)洗脫液速度約為3毫米/秒，體積流速為每小時(shí)4升(25毫米柱)，或每小時(shí)10升(40毫米柱)。
在制備HPLC中，樣品置于柱上的方式是最重要的。溶液盡可能地稀，但總體積不大于用來洗脫所要的峰的(洗脫液)體積的四分之一。這樣，峰的展寬不會(huì)比使用很小樣品所得到的流出峰大10%。如果注入小量的濃溶液，局部超載可能很嚴(yán)重，結(jié)果
引起分辨率的喪失。
在25%注射體積規(guī)則的基礎(chǔ)上，對于5000塔板的柱，可注射的樣品體積(k'=4時(shí))對于兩根柱(25和40毫米柱)分別為15和150毫升。幾乎沒有超載的樣品量將各自為0.25克和1克，相應(yīng)的初始溶質(zhì)濃度低于2%。
注1高斯誤差曲線
高斯誤差曲線的一般形式
y=yoexp(-㏄²/2σ²)
如圖2-12所示,σ稱為標(biāo)準(zhǔn)偏差，就是在y=yo/∠e也既曲線拐點(diǎn)處的半峰寬度。峰的基底寬度以ω表示，由得，等于4倍標(biāo)準(zhǔn)偏差:ω=4σ限定ω的切線相交于高度y=2yo/∠e處，并包圍一個(gè)面積4σyo/∠e =2.422yoσ高斯峰的面積是A=∠2π(yoσ)=2.508σyo
這一面積比三角形的面積大3.2%。
半峰高的寬度是
ω½=(81n2)
½σ=∠5.54σ=2.35σ
.jpg "圖2-12高斯誤差曲線的主要特征")
圖2-12高斯誤差曲線的主要特征
注2保留值參數(shù)
色譜中保留值的基本關(guān)系式
譜帶速度
R-----------------------
洗脫液速度
流動(dòng)相中的溶質(zhì)量qm
=----------------------------------------------------------------------
流動(dòng)相中的溶質(zhì)量qm+固定相中溶質(zhì)量qs
9m 1 1
=---------------=--------------------=---------
9m+qs 1+qs/qm 1+k’
R與紙色譜和薄層色譜中的Rι,值具有同樣意義。k' 稱作柱的容量比。在表現(xiàn)很好的色譜中，柱有效地在平衡狀態(tài)運(yùn)行，因此
K'=qs(eq)/qm(eq)=Cs(bq),Vs/Cm(eq)Vm
= K(Vs/Vm)
式中Cs(eg)，Cm(bq)是固定相和流動(dòng)相中的平衡濃度，而Vs,Vm是固定相和流動(dòng)相的體積; K是溶質(zhì)在兩相間的平衡分配比(有時(shí)以D表示)。k由下列方程與熱力學(xué)參數(shù)相聯(lián)系
⊿G=G0s-Gom=RTInK
=-RTInk'+RTIn(Vs/Vm)
⊿H=Hs-Hm=RT²dlnK/dT=RT²dInk'/dT
這樣，從流動(dòng)相到固定相的轉(zhuǎn)移熱(以及轉(zhuǎn)移熵)可由通過在一個(gè)溫度范圍內(nèi)測量K和K'而直接求得。
如第一個(gè)方程中表明的，R和K'有簡單的關(guān)系：
R=1/(1+k')以及k'=(1-R)/R
如果兩個(gè)溶質(zhì)的R和k'值是R1和R2,以及K'1和K'2，假定溶劑移動(dòng)了一段距離Z,則譜帶的移動(dòng)距離及其分離由下式給出
⊿z=z?-Z?=(R?-R?)zo
﹣z=1/2(z?+z?)=1/2(R?+R?)zo
因此
R=½(R?+R?)
另一方面，采用k'的表示法
1 1
⊿z=z?-z?={-----------=------------}z0
1+k'? 1+k'?
k'?-k'?
=--------------------------z0
(1+k'?)(1+k'?)
⊿k'
=-----------------------z0
(1+k'?)(1+k'?)
1 1 z
z=½(z?﹢z?)={------------=-------------}-------
1+k'? 1+k'? z0
2+k'?+k'? (1+k')z0
=-------------------------Z0=---------------------
(1+k'?)(1+k'?) (1+k'?)(1+k'?)
因此 ⊿z ⊿k'
----------=----------
z 1+k'
注3分配等溫線及k'值
考慮一個(gè)吸附體系，其吸附等溫線是每克吸附溶質(zhì)對流體相(在色譜中為流動(dòng)相)中溶質(zhì)濃度作圖。圖2-13是一個(gè)典型的例子，其中ms=吸附劑(即固定相)的量。為了轉(zhuǎn)換成色譜表示方式，注意弦的梯度是
9s/ms. qsVm
梯度=---------------=---------------=k'(Vm/ms)
Cm 9mms
這樣k'=qs/qm的值與弦的梯度成比例，并是Cm的函數(shù)，只要吸附等溫線是非線性的。對于一個(gè)典型的等溫線，在低吸附量時(shí)，Cm增加時(shí)k'就降低，低濃度比高濃度的溶質(zhì)更強(qiáng)烈地保留。色講中的這個(gè)效應(yīng)是產(chǎn)生拖尾峰，如圖2 -3(a)所示，高濃度的
峰最大值先出來，后面有一個(gè)到低濃度的尾巴。
.jpg "典型的非線性吸附等溫線及其與柱容量比k'的關(guān)系")
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