凝膠色譜法的原理是什么?
實(shí)驗(yàn)室k / 2019-07-27
凝膠色譜法是六十年代發(fā)展起來的一種簡(jiǎn)便有效的分離分析方法,由瑞典科學(xué)家Flodin首先試制成交聯(lián)葡聚糖(商品名Sephadex),用于分離生物大分子取得了滿意的效果?,F(xiàn)今用來作為凝膠色譜填充劑的,如葡萄糖凝膠、瓊脂糖凝膠、聚丙酰胺凝膠等,都是一種經(jīng)交聯(lián)而具有立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的多聚體,它們化學(xué)惰性,大多數(shù)具有極性基團(tuán),能吸收大量水分或其他極性溶劑。凝膠吸收溶劑后溶脹而在內(nèi)部留下了孔隙,根據(jù)聚合時(shí)的交聯(lián)度,使它具有一個(gè)排阻分子量的范圍。在這范圍以下的分子能自由滲透到凝膠顆粒內(nèi)部的孔隙而被保留;在這范圍以上的分子由于分子較大,不能滲透到顆粒內(nèi)。被排阻在凝膠顆粒外,直接隨洗脫劑流動(dòng)而不被保留;介于大小分子之間的中等大小分子則以不同程度滲透到孔隙內(nèi)部,以致有不同程度的保留。因此,用溶脹后的凝膠裝入色譜柱中,采用一般的色譜方法,就能使分子量大小不同的物質(zhì)因進(jìn)入凝膠顆粒網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的能力不同而達(dá)到分離和純化目的。根據(jù)它的分離機(jī)理又可以把凝膠色譜稱為分子篩色譜、凝膠滲透色譜、分子排阻色譜和凝膠過濾等,雖然名稱不一,但使用的技術(shù)是相同的。
凝膠色譜可視為一種“新的分配系統(tǒng)”。在此系統(tǒng)中,凝膠顆粒之間的液相體積稱為外水體積,用符號(hào)V0表示,作為流動(dòng)相;凝膠顆粒孔隙內(nèi)的液相體積稱為內(nèi)水體積,用符合Vi表示,作為固定液相,溶質(zhì)在這兩液相中進(jìn)行分配。色譜的基本方程VR=Vm+KVs同樣適用于凝膠色譜。
最簡(jiǎn)單和最理想的凝膠色譜形式,是設(shè)想凝膠顆粒內(nèi)的孔隙呈圓錐形,且所有的孔隙具有相同的形狀和大小。根據(jù)溶質(zhì)分子的大小決定它滲透到圓錐體孔隙的程度,大分子的溶質(zhì)因?yàn)樘螅灾峦耆荒苓M(jìn)入孔隙,而直接隨洗脫劑流出柱外,它的分配系數(shù)K=0,保留體積VR等于外水體積V0(VR=V0);如果是相當(dāng)小的分子或離子,它們將自由進(jìn)出凝膠顆粒孔隙的內(nèi)外,使顆粒內(nèi)外的濃度相等,即分配系數(shù)K=1,所以,對(duì)小分子言,它的保留體積VR等于外水體積V0與內(nèi)水體Vi之和(VR=V0+Vi);介于大小分子之間的分子則以不同程度滲透到圓錐體的孔隙內(nèi),其保留體積也介于大、小分子的之間,K值介于0~1之間。正由于大小不同的分子滲透到圓錐體孔隙的深度不同,才使它們?cè)谀z柱上各自的保留體積不同,而得以分離。
在凝膠色譜中,由于K<1,所以,它的極限使得凝膠色譜有獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn),即分配等溫線呈線性。在整個(gè)色譜分離的過程中,溶質(zhì)在Vi中的濃度與在V0中的濃度呈正比,洗脫峰為對(duì)稱形高斯曲線。又由于K的極大值為1,所有的組分必須在V0+Vi的體積中流出,因此,只需等到VR=V0+Vi,便可以繼續(xù)上樣,即使是未知樣品也可自動(dòng)進(jìn)樣。
然而,上面的過程僅是基于簡(jiǎn)單的排阻理論,是一個(gè)理想的過程。實(shí)際上,還常常伴有其他的機(jī)理在起作用。如有一部分內(nèi)水體積為凝膠所吸附,小分子不能進(jìn)入這一部分液相,使它的K值小于1;又如凝膠還具有一些吸附力,使溶質(zhì)分子保留在其表面,尤其是有些溶質(zhì)與凝膠形成氫鍵則更是如此。對(duì)一些強(qiáng)吸附物質(zhì)的K值可以高到20左右,這樣,它的保留體積就大大地大于V0+Vi。