單分子光譜
化學(xué)先生 / 2019-09-02
早在量子力學(xué)建立的初期，著名的諾貝爾獎(jiǎng)獲得者Feyneman就夢(mèng)想著能在原子、分子尺度上觀察和操縱物質(zhì)世界，然面多年以來，人們對(duì)微觀世界的觀測(cè)和研究都是建立在系統(tǒng)平均(system average)的基礎(chǔ)上。直到20世紀(jì)80年代掃描隧道顯微鏡、熒光探針、光鑷技術(shù)等的出現(xiàn)，進(jìn)人20世紀(jì)90年代單分子科學(xué)的形成與發(fā)展才使人們真正實(shí)現(xiàn)了Feyneman的夢(mèng)想。
顧名思義， 單分子光譜就是單個(gè)分子的光譜，實(shí)際上通常是對(duì)單個(gè)生 物分子動(dòng)態(tài)行為的光譜分析。那么為什么要進(jìn)行生物單分子光譜的研究呢?因?yàn)樵谄胀ǖ墓庾V技術(shù)中，實(shí)驗(yàn)中探測(cè)到的是大量分子的綜合平均效應(yīng)，得到的是系統(tǒng)的平均響應(yīng)和平均值，這一平均效應(yīng)掩蓋了許多特殊的信息。而單分子光譜研究可以排除系統(tǒng)的平均效應(yīng)，有利于復(fù)雜環(huán)境中同種分子不同行為的分析，通過對(duì)體系中的單個(gè)分子進(jìn)行研究，從而得到單分子體系的動(dòng)力學(xué)過程。例如，可以實(shí)時(shí)了解生物大分子構(gòu)象變化的信息:可以觀察微環(huán)境對(duì)單分子體系的影響，從面得到與分子微環(huán)境相關(guān)的信息。目前主要的技術(shù)手段包括生物大分子熒光光譜，單分子熒光能量轉(zhuǎn)移譜，與原子力顯微鏡結(jié)合進(jìn)行單分子水平的分子間相互作用力的測(cè)量，以及可進(jìn)行單分子操作的激光光鉗，高時(shí)間分辨率的單分子軌跡追蹤等。
熒光單分子檢測(cè)技術(shù)是用熒光標(biāo)記來顯示和追蹤單個(gè)分子的方法。1976 年，Hirschfeld檢測(cè)到標(biāo)有80~100個(gè)發(fā)光團(tuán)的單個(gè)抗體分子，開創(chuàng)了單分子檢測(cè)的先河。1994 年Moerner首先在水容器風(fēng)干表面對(duì)單熒光團(tuán)進(jìn)行顯像觀測(cè)，1995 年Funatsu 等又利用全內(nèi)反射顯微鏡(total internal reflection microscopy, TIRFM) 在水溶液中觀察到單個(gè)熒光基團(tuán)標(biāo)記的蛋白質(zhì)分子，井追蹤其運(yùn)動(dòng)軌跡，真正實(shí)現(xiàn)了SMS對(duì)單熒光分子的檢測(cè)。由于熒光信號(hào)測(cè)量靈敏度高以及光子對(duì)分子干擾最輕微，SMS被廣泛應(yīng)用于單分子研究。尤其對(duì)于需觀察細(xì)胞內(nèi)單分子實(shí)時(shí)變化的細(xì)胞生物學(xué)研究，SMS可能是唯-有效的技術(shù)。
單分子熒光探測(cè)必須滿足兩個(gè)基本要求:一是在被照射的體積中只有一個(gè)分子與激光發(fā)生相互作用;二是要確保單分子信號(hào)大于背景的干擾信號(hào)。背景信號(hào)來自于Raman散射、Rayligh散射、溶劑中雜質(zhì)、蓋玻片的背景熒光和探測(cè)器的暗電流。因此，行單分子探測(cè)要求:①激發(fā)容積要小，因?yàn)楸尘暗奈张c激發(fā)體積成正比，盡量減小激發(fā)體積可降低背景干擾;②高效的收集光學(xué)系統(tǒng);③靈敏的探測(cè)器;④采用針孔裝置，或?qū)⑷軇┲须s質(zhì)預(yù)漂白以及用低熒光光學(xué)材料等方法清除背景熒光。
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