洗脫
抖化學(xué) / 2022-11-17
一旦吸附劑制成之后,可以用兩種方式使之作為分離系統(tǒng)使用。對于更成熟的色譜法,則需用常規(guī)的柱方法。然而分批分離則簡單地包括將混合物與吸附劑淤漿共同保溫,在燒結(jié)板上過濾以除去吸附劑,這常常是合適的,這樣就免去了耗費(fèi)時間的柱的填充和平衡。
如果選用柱系統(tǒng),洗脫就可用很多方法來完成。通常可以找到一種物理參數(shù)如pH或離子強(qiáng)度的適當(dāng)?shù)拇蠓茸兓?,或者是分段的或者是梯度的。曾?a href="http://f670.cn/goods.php?id=483">脲或鹽酸胍這類變性劑來洗脫被強(qiáng)烈吸附的、可再生的蛋白質(zhì)。有時,特別是當(dāng)涉及到免疫吸附劑時,其親和性極大以致根本不能使用常規(guī)洗脫法。在這些情況下,人們可借助于使用可降解的間隔基“手臂”。偶氨橋鍵很有用,因?yàn)樗鼈兛梢栽谶B二亞硫酸鹽還原作用的溫和條件下斷裂。為了促進(jìn)從抗球蛋白免疫吸附劑上回收淋巴球細(xì)胞,可使用明膠間隔基,在B淋巴球的生物吸附之后,該間隔間即可用骨膠原酶消化掉,從而釋出具有充分細(xì)胞活性的免疫球蛋白群。最高超的洗脫法還在于進(jìn)一步利用生物特異性。洗脫劑中含有過量的配位體,它就與固定的配位體競爭吸附的分子。這種類型洗脫的功效強(qiáng)烈提示,生物親和色譜法比非特異的效應(yīng)優(yōu)越。下面討論的包含一般配位體的此技術(shù)的一個方面,生物洗脫起重要的作用。
等度洗脫
等度洗脫又稱無梯度洗脫,恒溶劑洗脫。在色譜洗脫過程中,是流動相的組成保持不變的洗脫方法。
高效液相色譜儀是一個強(qiáng)有力的分離分析工具,但是作為洗脫用的流動相并不單純是一種溶劑,而由兩種或兩種以上的溶劑(或緩沖液)以不同百分比組合而成。例如:甲醇-水、乙腈-磷酸緩沖液和己烷-乙酸乙酯等,以不同百分比組成流動相。如果洗脫過程中溶劑的混合組成不變,就稱作等強(qiáng)度洗脫,即溶劑強(qiáng)度保持不變。如果洗脫過程中溶劑的混合組成隨時間變化,稱作梯度洗脫。依照溶劑強(qiáng)度隨時間變化的梯度洗脫技術(shù)在液相色譜中是十分有用的,不少難分離的物質(zhì)對以及極性相差較大的混合物需要依據(jù)梯度洗脫得到分離:
梯度洗脫
對于組分復(fù)雜的樣品,采用單一的流動相系統(tǒng)很難得到理想的分離結(jié)果。要么分離時間太長,要么分離度太差。梯度洗脫是指在分離過程中逐漸改變?nèi)軇┑慕M成,使溶劑強(qiáng)度從分離開始到結(jié)束逐漸增加的洗脫方式。即隨著時間改變,連續(xù)改變流動相的極性,使復(fù)雜組分得到良好的分離。
梯度洗脫方式有兩類
1.外梯度洗脫外梯度洗脫又稱低壓梯度洗脫,即將溶劑在常壓下,通過程序控制器使溶劑按一定比例混合后再由高壓泵輸入到色譜柱。
2. 內(nèi)梯度洗脫內(nèi)梯度洗脫又稱高壓梯度淋洗,是將溶劑經(jīng)高壓泵加壓后再混合的洗脫方式。
梯度洗脫的特點(diǎn)
柱效提高;
2. 檢測器的靈敏度得到改善;
3. 當(dāng)復(fù)雜樣品中不同性質(zhì)成分的保留因子(k')相差很大(幾十倍至幾百倍)時,使用梯度洗脫可以得到更好的分離效果。
梯度范圍是指流動相中強(qiáng)溶劑分別在起始液和終止液中的濃度。調(diào)節(jié)梯度范圍對得到最佳的梯度分離起重要作用。
注意事項(xiàng)
在進(jìn)行梯度洗脫時,由于多種溶劑混合,而且組成不斷變化,因此必然帶來一些特殊的問題,必須充分的重視。
1. 要注意溶劑的互溶性,不相混溶的溶劑不能用作梯度洗脫的流動相有些溶劑在一定的比例內(nèi)互溶,超出一定的范圍后就不會互溶。例如:乙腈和1mol/L的醋酸銨(pH5.16)做梯度洗脫,乙腈含量超過70%時就會出現(xiàn)不溶;當(dāng)有機(jī)溶劑和緩沖溶液混合時還可能析出鹽的結(jié)晶體,尤其使用磷酸鹽時需特別小心。
2. 梯度洗脫所用的溶劑純度要求更高,以保證好的重現(xiàn)性進(jìn)行樣品分析前必須進(jìn)行空白梯度洗脫,以辨認(rèn)溶劑雜質(zhì)峰,因?yàn)槿跞軇┲械碾s質(zhì)富集在色譜柱頭上后會被強(qiáng)的溶劑洗脫出來
3. 混合溶劑的黏度常隨組成而變化,因此在梯度洗脫時常會出現(xiàn)壓力變化例如純水或甲醇的黏度都比較小,但是當(dāng)二者以相近的比例混合時黏度會增大很多。因此要防止梯度洗脫過程中壓力超過輸液泵或色譜柱所能承受的最大壓力。
4. 每一梯度洗脫程序完成后,必須對色譜柱進(jìn)行重新平衡,使其恢復(fù)到初始的狀態(tài)一般需要10~30倍柱容積的初始流動相,使固定相和初始流動相達(dá)到完全平衡。
5. 注意梯度洗脫用水的有機(jī)物殘留往往在等度洗脫時用的水,在梯度洗脫時出現(xiàn)未知峰(“鬼峰”)。這是因?yàn)樵谔荻冗^程中,水的比例很高時流動相洗脫能力很低,此時水中的有機(jī)物殘留就被色譜柱吸附并濃縮,當(dāng)強(qiáng)溶劑占高比例時,濃縮的有機(jī)物被高洗脫能力的流動相洗脫而流出色譜柱,并成為一個色譜峰,從而干擾分析。
梯度洗脫程序及其模式
1.線性梯度
在梯度洗脫時,流動相強(qiáng)度的變化與梯度時間成線性比例。在一定時間內(nèi)流動相強(qiáng)度增加越大,直線斜率越大。
2.指數(shù)梯度
在梯度洗脫時,流動相強(qiáng)度隨梯度時間變化稱指數(shù)關(guān)系。
凹形:梯度起始階段強(qiáng)度變化緩慢,隨時間增加,強(qiáng)度變化加快。
凸形:起始階段梯度速度變化快,終止階段梯度速度變化慢。