甲烷氧化菌的微生物學(xué)特征
化學(xué)先生 / 2019-07-27
1906年，Sohngen首先發(fā)現(xiàn)，在厭氧條件下生成的大量甲烷，釋放到大氣中以后其濃度大大降低。他認(rèn)為，這可能是由于一些微生物或其它因素可以使甲烷分解造成的，繼之他就分離出世界上第一株甲烷氧化菌Bacillus meth-anicus。自此以后不斷有新的菌株被分離出來，到目前為止已發(fā)現(xiàn)了一百余株甲烷氧化菌?；诩?xì)胞形態(tài)學(xué)分析、細(xì)胞體止期類型、細(xì)胞內(nèi)質(zhì)膜的精細(xì)結(jié)構(gòu)和一些生理學(xué)特性，Whittenbury將甲烷氧化菌分為五種類型，即甲基彎菌屬(Methylosinus)、 甲基孢囊菌屬(Methylecystis)、 甲基單胞菌屬(Meth-ylomonas)、甲基桿菌屬( Methylobacter)和甲基球菌屬(Meth ylococcus)。根據(jù)細(xì)胞代謝途徑，這些不同類型的菌株又被劃分為3個(gè)菌群:I型、II型、X型。近幾年來，又報(bào)道了5個(gè)新的甲烷氧化菌類型，如圖2-1所示。也有些報(bào)道將X型甲烷氧化菌歸人到I型菌中，因?yàn)樗谋硇秃痛x途徑類似于I型菌，只是它含有低水平的絲氨酸代謝所需要的二磷酸核酮糖磷酸酶。
從內(nèi)質(zhì)膜的精細(xì)結(jié)構(gòu)看，I型菌主要含有圓盤狀堆積的內(nèi)質(zhì)膜束貫穿整個(gè)細(xì)胞，膜內(nèi)含有16碳脂肪酸，主要是通過單磷酸核酮糖(RuMP) 代謝途徑，代謝由甲烷經(jīng)甲醇轉(zhuǎn)化生成的甲醛，II型菌的內(nèi)質(zhì)膜排列在細(xì)胞外膜周圍形成環(huán)狀，膜中含有18碳脂肪酸，主要是通過絲氨酸(serine) 代謝途徑代謝甲醛。最近又有人報(bào)道，甲烷氧化菌也存在一種基于四氫甲酰氧嘌呤的C1代謝途徑，因此甲烷氧化菌如何代謝甲醇將有可能進(jìn)一步討論。Bowman 研究比較了136個(gè)甲烷氧化菌中的124個(gè)菌的表型，他應(yīng)用了大量的分類學(xué)研究方法，包括DNA-DNA雜交，脂肪酸組成分析，染色體的理化性質(zhì)和生物進(jìn)化關(guān)系的分析，5S rRNA和16S rRNA的進(jìn)化相關(guān)性分析。通過這些分析表明，能夠利用絲氨酸代謝途徑的甲烷氧化菌組成了獨(dú)特的ar Proteobacteria菌群，利用單磷酸核酮糖代謝途徑的甲烷氧化菌形成了r Proteobacteria 菌群，而且存在單磷酸核酮糖代謝途徑的菌不利用甲烷為碳源，從而構(gòu)成了另一類甲烷氧化菌β Proteobacteria菌群。
甲烷氧化菌是一類革蘭陰性菌，在利用甲烷為唯一碳源和能源方面是獨(dú)一無二的。幾乎所有的甲烷氧化菌都是依靠甲烷生長，也有個(gè)別甲烷氧化菌可以利用甲醇、甲胺、鹵代甲烷、含硫的甲基化合物和一些裂解的有機(jī)化合物中的甲基基團(tuán)作為碳源。在甲烷氧化菌氧化甲烷的過程中，甲醛是這個(gè)代謝過程的重要中間體，細(xì)胞以吸收甲醛的形式作為碳源。幾乎所有的甲烷氧化菌都是專性甲烷氧化菌，但也有人報(bào)道，還存在個(gè)別的兼性甲烷氧化菌或限制性兼性甲烷氧化菌。不同屬、種的甲烷氧化菌有著不同的代謝一碳物質(zhì)的途徑和能力，它們的細(xì)胞結(jié)構(gòu)和化學(xué)組成也不同，因此也有不同的一碳 化合物的代謝調(diào)節(jié)機(jī)制。不同菌株對營養(yǎng)物質(zhì)的需求能力，決定了該菌株在不同生長環(huán)境中的競爭能力。因此要理解甲婉代謝的控制因素和甲烷氧化菌的生態(tài)學(xué)，就必須了解不同甲烷氧化菌的生理學(xué)知識。
甲烷氧化菌在生理上和氨氧化菌有相似之處，它們氧化甲烷和氨氧化菌氧化氨的方式是非常相似的，自養(yǎng)生物氨氧化菌屬于β Proteobacteria菌群，也能夠氧化甲烷，但效率非常低。如前所述，甲烷的氧化主要發(fā)生在有氧的環(huán)境中，迄今沒有報(bào)道甲烷在厭氧環(huán)境中被微生物氧化的生物化學(xué)過程。
在自然界中，甲烷氧化菌分布于濕地、沼澤、河流的沉積物、稻田、海洋、池塘、被污染的土壤、落葉、森林、溪流、污水管道的沉積物中，也有一些與海洋動(dòng)物臟器共生的甲烷氧化菌。目前，已被表征過的菌株均是專性甲烷氧化菌，它們均有固氮作用，已發(fā)現(xiàn)的甲烷氧化菌可能僅僅是自然界中很小的- .部分。隨著甲烷氧化菌檢測技術(shù)的進(jìn)展，相信會(huì)有更多的、不同的甲烷氧化菌被發(fā)現(xiàn)。一般來講，甲燒氧化菌的檢測是利用氣相色譜測定其對甲烷的消耗。近幾年，利用免疫熒光抗體和核酸探針檢測的方法，或直接從環(huán)境樣品中克隆的分子生物學(xué)方法用來檢測自然界中的甲烷氧化菌也是非常有效可行的。
隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，利用基因序列、微生物分類及微生物進(jìn)化的關(guān)系鑒定甲烷氧化菌，也是近年來建立起來的新方法。例如，MeDonald等利用甲烷氧化菌中羥基化酶a亞基和甲醇脫氫酶組分A的基因序列設(shè)計(jì)的引物被用于篩選、鑒定環(huán)境中甲烷氧化菌的工作中，就像16S rDNA雜交探針用于菌株的篩選工作一樣準(zhǔn)確、高效，因?yàn)楫?dāng)其它組分的變化較大的時(shí)候，這兩個(gè)組分是保守的11。甲烷氧化菌的pMMO與氨單加氧酶(AMO)的基因序列有較高的序列保守性，由此推斷甲烷氧化菌與氨氧化菌在生物進(jìn)化關(guān)系上是密切相關(guān)的。但該方法有一個(gè)明顯的缺陷，不是所有的微生物都可以采用此方法來鑒定，因?yàn)樵谙嗤h(huán)境中同類微生物的基因序列可能并不都是保守的。通過脂肪酸鑒定微生物結(jié)構(gòu)也是有效的方法之一，特別是對于甲烷氧化菌的結(jié)構(gòu)鑒定是非常有用的。
甲烷氧化菌不能生存在單純的大氣環(huán)境中，因?yàn)榇髿庵械募谉蛔阋灾С制溲趸磻?yīng)和細(xì)菌的自身生長。只有在土壤和水的沉積物存在下，剛從厭氧細(xì)菌層中釋放出來的甲烷，才可以維持甲烷氧化菌的生理活動(dòng)。目前被分離出來的甲烷氧化菌大多生活在室溫和中性環(huán)境中，其最適pH為3.5~8.0.近年來，也發(fā)現(xiàn)了一些在極端環(huán)境中生長的甲烷氧化菌，如熱溫泉、酸性的沼澤和南極條件下生長的菌株。在些湖泊中， 甲烷氧化菌存在 于厭氧層和有氧層之間，特別是有大量的菌株生長在植物的根陳附近，因?yàn)樵谀抢镉谐练e層的甲烷在支持菌株的生長，并有來自于植物根部的氧，甲燒氧化菌的最佳生長環(huán)境是氧濃度為20%左右。在高氧濃度和低甲烷濃度環(huán)境中，將有利于I型甲烷氧化菌的生長，反之，則有利于II型甲烷氧化菌的生長。
甲烷氧化菌能催化生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白和許多精細(xì)化學(xué)品的反應(yīng)。它們不但能夠使厭氧菌產(chǎn)生的甲烷羥基化，而且可以使其它一些烷烴、烯烴和芳香烴發(fā)生選擇性氧化。甲烷單加氧酶是甲烷氧化細(xì)菌中的主要酶系，在常溫、常壓下，能夠催化甲烷轉(zhuǎn)化為甲醇的反應(yīng)，然后在一系列脫氫酶作用下生成CO2和H2O:
在化學(xué)上實(shí)現(xiàn)從甲烷到甲醇的直接轉(zhuǎn)化是很困難的，因?yàn)榧淄槭翘悸然衔镏凶铍y發(fā)生羥基化的一個(gè)底物。它的C- H鍵十分穩(wěn)定，鍵能為438. 8kJ/mol,離子化電位為12.5eV,質(zhì)子親和能4.4eV,酸性pK。=48。甲烷單加氧酶在細(xì)胞中有兩種不同表現(xiàn)形式:溶解性甲烷單加氧酶(soluble MMO,簡稱sMMO)和顆粒性甲烷單加氧酶( particulate MMO,簡稱pMMO)，它們都可以催化CH生成CH3OH。一般來講，在目前已發(fā)現(xiàn)的甲烷氧化細(xì)菌中均含有顆粒性甲烷單加氧酶，它具有較窄的底物專一性，附著在細(xì)胞內(nèi)質(zhì)膜上。但依靠生長環(huán)境中Cu2+的調(diào)節(jié)，一部分甲烷氧化細(xì)菌能夠表達(dá)溶解性甲烷單加氧酶，特別是在II型甲烷氧化細(xì)菌中，當(dāng)Cu2+濃度較高時(shí)，pMMO得到表達(dá);而Cu2+濃度較低時(shí)，sMMO得到表達(dá)。與pMMO相比，sMMO的作用底物較寬，活性高，表現(xiàn)出具有更寬的底物專一性，且存在于細(xì)胞質(zhì)中，可催化其它低碳烷烴的羥基化和低碳烯烴環(huán)氧化和脂肪烴、芳香烴的羥基化反應(yīng)，以及一些環(huán)境污染物(如三氯乙烯等)的降解。正是由于這種寬底物專一性，人們認(rèn)為sMMO在生物催化過程中會(huì)發(fā)揮更重要的作用。從而引起了許多科學(xué)家的興趣，并積極努力開發(fā)些新的烴類 選擇氧化過程和生物除污新方法，在能源、化工和環(huán)境保護(hù)方面，有著更為廣闊的應(yīng)用前景[17]。迄今為止已對七種甲烷氧化細(xì)菌的sMMO進(jìn)行了分離純化和表征: Methylocystis sp. WI14、Methylosinus trichosporium OB3b、Methylocystis sp. M、Meth ylococcus cap-sulatus Bath、 Methylobacterium sp. CRL 26、Meth ylosinus trichosporiumIMV 3011 和Methylomonas sp. GYJ3[18~25]。尤其對源于M. trichosporiumOB3b和M.capsulatus Bath 的sMMO進(jìn)行了較系統(tǒng)的研究。1984年，Datono)從所研究的Bath 菌中得到了一個(gè)三組分復(fù)合酶體系:羥基化酶(MMO hydroxylase,簡稱MMOH),分子量為220kDa@,由三個(gè)亞基a、B、γ組成(aBY)2 二聚體，含2~4個(gè)Fe的金屬蛋白:調(diào)節(jié)蛋白B(MMOB)，分子量為14~17kDa，不含輔基和金屬蛋白;還原酶(MMO reductase, 簡稱MMOR),分子量為38~45kDa,含1個(gè)Fe2S2(鐵硫蛋白)和輔基FAD(flavinadenine dinucleotide,核黃素腺嘌呤核苷酸)的蛋白。其它的sMMO在結(jié)構(gòu)構(gòu)型上和它們都是非常相似的，都不含有血紅素，除了一個(gè)甲烷氧化菌Meth-ylobacteriumsp.CRL-26之外，其它菌株的sMMO也都是由三個(gè)組分組成的一個(gè)復(fù)合酶體系，含有雙核鐵活性中心，在這里分子氧被活化，一個(gè)氧插人到甲烷的C- H鍵中，形成甲醇，另一個(gè)氧形成水。與其它具有應(yīng)用價(jià)值的酶相比較，顯然有關(guān)甲烷單加氧酶的基礎(chǔ)性研究信息是缺乏的。羥基化酶是sMMO催化活性的關(guān)鍵組分，也是酶催化反應(yīng)的活性中心，對它的深入研究，有助于sMMO反應(yīng)機(jī)理和其生物轉(zhuǎn)化、生物除污功能的深入研究。從MMOH的晶體分析看，雙核鐵活性中心位于距a、β亞基形成的谷底1. 2nm處。組分B是一個(gè)小分子調(diào)節(jié)蛋白，它對整個(gè)反應(yīng)循環(huán)的反應(yīng)速率、MMOH的結(jié)構(gòu)以及產(chǎn)物的分布都有重要的作用，它的活性可能被肽鏈的N端水解所調(diào)節(jié)，在低濃度時(shí)，組分B調(diào)節(jié)羥基化酶從一個(gè)氧化酶成為一個(gè)羥基化酶，穩(wěn)定氧激活所必需的中間體，飽和量的組分B明顯增加了這個(gè)中間體，加速了甲烷到甲醇的轉(zhuǎn)化。組分C的功能是接受輔酶NADH電子，將電子傳遞到羥基化酶，含有[2Fe-2S]中心，能夠加速電子從NADH到活性中心的轉(zhuǎn)移。
美國Lipscomb、Lippard、 Newcomb和英國Dalton、Murrell 等教授從酶的生物學(xué)特征、分子結(jié)構(gòu)、催化功能、活性中心、反應(yīng)機(jī)理和分子生物學(xué)等方面，對甲烷氧化菌和甲烷單加氧酶進(jìn)行了深入的基礎(chǔ)研究。研究較為全面面深人的菌株是Meth ylococcus ca psulatus Bath, Meth ylosinus trichosporiumOB3b.自20世紀(jì)80年代中期開始，我國趙樹杰、李樹本、邢新會(huì)等教授，也先后開展了甲烷氧化菌的篩選和甲烷單加氧酶催化化學(xué)與功能模擬的研究工作。不但成功地篩選了多株甲烷氧化細(xì)菌，并進(jìn)行了酶和細(xì)胞的固定化，以及丙烯環(huán)氧化制環(huán)氧丙烷，甲烷生物催化氧化制甲醇和三氯乙烯(TCE)降解等生物催化反應(yīng)研究。從酶化學(xué)水平揭示了甲烷單加氧酶對分子氧和小分子烴的活化機(jī)理，取得了一系列進(jìn)展。
和化學(xué)催化相比，生物催化過程也存在著某些固有的弱點(diǎn)，如作為生物催化劑的酶在催化循環(huán)中自身不夠穩(wěn)定、催化效率低，以及輔酶難以再生等。這些因素都嚴(yán)重影響著生物催化反應(yīng)循環(huán)的連續(xù)性，制約了當(dāng)前酶化學(xué)的發(fā)展和酶催化在化學(xué)工業(yè)中的應(yīng)用。近幾年，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的日益成熟和迅猛發(fā)展，利用基因工程技術(shù)構(gòu)建、改造的工程菌，有可能改善天然酶的性質(zhì)或使其具有新功能，為解決生物催化中存在的這些國際性的技術(shù)難題開辟了新途徑。然而，和醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)相比，分子生物學(xué)在化學(xué)化工中的應(yīng)用研究進(jìn)展還非常緩慢。
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