甲烷單加氧酶中組分D-orfY的發(fā)現(xiàn)與功能和定點突變實驗及分子生物學(xué)研究
化學(xué)先生 / 2019-07-29
1:甲烷單加氧酶中組分D-orfY的發(fā)現(xiàn)
在第一個甲烷單加氧酶的基因序列測定中,就發(fā)現(xiàn)在整個基因序列申有一個小的開放閱讀框,編碼為orfY,但迄今尚未從甲烷氧化細(xì)菌中分離出該蛋白,對它的功能也不清楚。該基因位于mmoZ與mmoC之間,分子量約12kDa,稱為MMOD,如圖2-2所示。Merkx 對這個位于mmoZ與mmoC之間,功能未知的片斷orfY,在E.coli 中進(jìn)行了克隆表達(dá),獲得了純的MMOD蛋白,通過WestenBolt分析,在Bath中確有MMOD存在。一個可能的解釋是該蛋白組裝在MMO雙鐵核中心內(nèi),其功能是通過MMOD與MMOH結(jié)合,對MMO的活性進(jìn)行調(diào)節(jié),如對丙烯環(huán)氧化反應(yīng)有一定的抑制作用,即MMOD有抑制MMO活性的功能。將二倍的MMOD添加到MMOH中,可使MMOH的UV光譜發(fā)生明顯變化,證明了該蛋白有可能組裝在MMOH雙核鐵中心內(nèi)。
2:甲烷單加氧酶的定點突變實驗
2002年,Callaghan[57]等發(fā)表了 針對組分B的不穩(wěn)定性原位突變試驗結(jié)果。他們發(fā)現(xiàn),由于組分B的N端12個氨基酸水解,造成了MMO的失活,其中最敏感的氨基酸殘基是Ser4-Tyr7.當(dāng)這些氨基酸殘基被突變后,水解速度明顯降低,組分B的穩(wěn)定性提高;當(dāng)這些氨基酸殘基被去除后,發(fā)現(xiàn)對MMO的活性產(chǎn)生很大影響;說明這些氨基酸殘基對MMO的活性和組分B的穩(wěn)定性是必需的。使這些必需的氨基酸發(fā)生水解的原因,可能是組分B內(nèi)在的親質(zhì)子活性,而在培養(yǎng)基中添加Cu2+之后,可使sMMO失活,但并未抑制組分B的水解。Brandstetter 對Bath菌的MMOB進(jìn)行突變發(fā)現(xiàn),在組分B的N端,Serl-Ala25 是不穩(wěn)定的,易發(fā)生水解,因此他們將Gly10突變?yōu)锳la, Gly13突變?yōu)镚In, Gly16 突變?yōu)锳la,結(jié)果水解被抑制。在這一工作中,他們使用pkk223-3質(zhì)粒和E.coliJM105宿主,pET-15b 質(zhì)粒和E. coli BL21宿主進(jìn)行突變體的表達(dá)。
3:顆粒性甲烷單加氧酶的分子生物學(xué)研究
對Bath菌的pMMO基因序列也有人進(jìn)行了基因測序和克隆表達(dá),發(fā)現(xiàn)三個亞基是pMOC、pMOA和pMOB,其基因序列與固氮菌中的氨單加氧酶基因序列非常相似,這說明它們在進(jìn)化中是密切相關(guān)的。Mtrichos porium OB3b和Methylocystis sp. M的全部pMMO基因序列已被克隆,它們由2個相同的單體組成,與氨單加氧酶序列的相似性相當(dāng)高,有42% ~ 87%的基因序列同一性和58%~95%的氨基酸序列同一性。1999年Stolyar將構(gòu)建的Bath菌染色體插人突變菌株,發(fā)現(xiàn)pMOC和pMOA亞基是高度疏水性的,pMOB有2個跨膜區(qū),表現(xiàn)出對E. coli宿主的毒性作用。因此,pMMO在異型宿主中表達(dá)可能比較困難,但它的基因序列信息可作為基因探針,用來檢測自然界中甲烷氧化菌的存在與多樣性。