甲烷單加氧酶的總體構(gòu)型
化學(xué)先生 / 2019-07-29
甲烷單加氧酶( methane monooxygenases, EC1.14. 13.25)的分子量約301kDa,研究比較深入的是可溶性甲烷單加氧酶sMMO,它包含三個(gè)組分:羥基化酶(sMMOH, 220~ 250kDa)、還原酶(sMMOR, 38~ 41kDa)和調(diào)節(jié)蛋白B (sMMOB, 15~ 18kDa). sMMOH是由三個(gè)亞基組成的二聚體(aβr)2,每個(gè)單體有一個(gè)雙核鐵活性中心，位于羥基化酶的a亞基上，a亞基既含有a螺旋也含有β折疊，也是sMMO中唯一存在β折疊的亞基，活性中心的Fe原子被a螺旋束所包圍，a螺旋束結(jié)構(gòu)延伸到雙核鐵中心的非極性腔中，通過(guò)研究核內(nèi)極性或非極性區(qū)域所處的位置，可以預(yù)測(cè)甲烷進(jìn)人活性中心的通道和電子轉(zhuǎn)移過(guò)程。β亞基、Y亞基均由a螺旋組成，從它們可以觀察亞基之間疏水、親水部分的相互作用。
活性中心呈現(xiàn)疏水性，對(duì)酶與小分子底物的相互作用至關(guān)重要。通過(guò)了解a螺旋束如何保持MMOH的構(gòu)型，可進(jìn)一步理解MMOB、MMOR與MMOH的結(jié)合位點(diǎn)，以及在活性中心上烷烴、烯烴如何被氧化。一般情況下，雙核鐵活性中心由4個(gè)谷氨酸、2個(gè)組氨酸、1個(gè)水分子配位，兩個(gè)鐵原子間由一個(gè)羥基氧橋或羰基橋(p-OH 或p-Oxo)連接，自然狀態(tài)下雙核鐵以氧化態(tài)形式存在，活性中心的Fe與6個(gè)配基結(jié)合，形成一個(gè)“鉆石”核結(jié)構(gòu)，如圖3-2所示。
sMMO的羥基化酶與其它蛋白，如蚯蚓血紅蛋白、核酸磷酸酯酶具有相同的p-羥基氧橋雙核鐵活性中心，但其催化性能不同，這可能是由μ~羥基氧橋雙鐵核活性中心的配位不同所決定的。還原酶(sMMOR)由2個(gè)城組成，一個(gè)是含有FAD( flavin adenine dinucle-otide,核黃素腺嘌呤二核苷酸)和NADH(煙酰胺腺嘌呤二核苷酸)的結(jié)合部位城(MMOR-FAD)，分子量為27.6kDa,由250(99~348)個(gè)氨基酸組成;另一個(gè)是含有[2Fe-2S] 的鐵氧化還原蛋白城(MMOR-Fd),由98(1~ 98)個(gè)氨基酸組成。調(diào)節(jié)蛋白B是一個(gè)分子量為16kDa的小分子蛋白，整個(gè)蛋白質(zhì)表面呈現(xiàn)疏水性，在酶催化反應(yīng)過(guò)程中起著調(diào)節(jié)作用，見(jiàn)圖3-2。
對(duì)于任何一個(gè)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的確定和模擬都要清楚了解它的四級(jí)結(jié)構(gòu)，而長(zhǎng)期以來(lái)對(duì)顆粒性甲烷單加氧酶(pMMO)的亞基結(jié)構(gòu)一直難以確定。1989 年，Smith和Dalton[1]首先獲得了由Bath菌部分純化出的pMMO,他們使用十二烷基β麥芽從該微生物的細(xì)胞膜上溶解出活性組分。發(fā)現(xiàn)pMMO也含有3個(gè)亞基，pMMA/pMMB/pMMC.來(lái)自于Bath菌的pMMO的活性中心約有2個(gè)Fe和15個(gè)Cu，形成了生核銅的活性中心結(jié)構(gòu)，活性中心位于pMMA上，也有可能位于pMMB上。
Takeguchi[2] 純化了OB3b的pMMO,測(cè)定出pM-24MO總分子量為326kDa,由2個(gè)亞基組成，分子量分別為25kDa和41kDa, 另外還有一個(gè)26kDa的蛋白存在，但未說(shuō)明它的四級(jí)結(jié)構(gòu)。Lieberman[3) 的研究則認(rèn)為，來(lái)自Bath菌的pMMO的總分子量為200kDa,由3個(gè)亞基組成，是個(gè)二聚體，這與Yu的工作很相似，但同時(shí)他們也觀察到有一個(gè)分子量為440kDa的四聚物存在。
2005 年，Lieberman 在Nature上發(fā)表了來(lái)自Bath菌的pMMO的晶體結(jié)構(gòu)，該晶體呈現(xiàn)高為10. 5nm、直徑是9nm的圓柱體型，是一個(gè)三聚體，很遺憾這個(gè)實(shí)驗(yàn)沒(méi)有給出酶的活性和其它性質(zhì)。同年，Kit-mitto[6]對(duì)有活性的Bath菌的pMMO進(jìn)行了三維結(jié)構(gòu)測(cè)定，也確認(rèn)它是一個(gè)三聚體，單體由47kDa、26kDa 和23kDa的三個(gè)亞基組成。
綜合其它報(bào)道總的來(lái)看，來(lái)自于Bath菌的pMMO活性中心趨向于含F(xiàn)e/Cu原子，來(lái)自于OB3b的pMMO活性中心趨向于只含Cu原子。在細(xì)胞外，四甲基對(duì)苯醌和NADH2能夠作為pMMO的電子給體，使pMMO能夠氧化1~5個(gè)碳原子的烷烴和烯烴，但不能氧化芳香烴化合物。
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