甲烷單加氧酶的譜學(xué)表征
化學(xué)先生 / 2019-07-30
MMOH 結(jié)構(gòu)的譜學(xué)表征
一系列譜學(xué)研究表明，MMOH雙核鐵中心含有一個μ-氫氧橋(pr-hydr-oxo)結(jié)構(gòu)，容易發(fā)生誘導(dǎo)變形，在反應(yīng)循環(huán)過程中受其它組分影響，可以隨外部環(huán)境的變化而改變。聯(lián)合使用多種譜學(xué)手段對MMOH的結(jié)構(gòu)變化進(jìn)行表征，有助于闡明MMO的反應(yīng)機(jī)理。根據(jù)文獻(xiàn)報道，在結(jié)構(gòu)化學(xué)中常用的各種現(xiàn)代光譜和波譜技術(shù)，都可以用來研究MMOH雙鐵核中心的構(gòu)型變化。它們包括ESR (electron spin resonace, 順磁共振)，Mossbauer, EXAFS(ex-tended X- ray absorption fine structural,外延X射線吸收精細(xì)結(jié)構(gòu))，ENDOR(electron nuclear double resonance,電子核雙共振)，CD( circular dichroism，圓二色)，RR ( resonance raman,共振拉曼)等。使用多種譜學(xué)方法對MMOH結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征發(fā)現(xiàn)，MMOH含有兩個基本相同的雙核鐵中心。自旋哈密頓函數(shù)證明，MMOH在結(jié)構(gòu)上與其它雙核鐵蛋白具有相似性。最重要的信息是Fe't態(tài)的自旋偶合要明顯低于其它蛋白，這表明其雙核鐵的Fe配位狀態(tài)可以發(fā)生較大的變化，包括配位數(shù)、配位幾何構(gòu)型、鏈的配位排列和簇極性環(huán)境等。MMOH中雙核鐵的氧化態(tài)(Fe3+-Fe+) 與外來分子的電子交換和偶合能力均較弱，MMOH的半還原態(tài)(Fe+-Fe2+) 可以為底物、產(chǎn)物、扣制劑和組分B提供與活性中心結(jié)合的機(jī)會，但只有在還原態(tài)(Fe2+-Fe2+)下，才可能完成催化氧化反應(yīng)的循環(huán)過程。
甲烷單加氧酶的活性中心處于羥基化酶的a亞基上，在酶催化反應(yīng)過程中，分子氧的一個O原子插人到烷烴的C H中，使烷烴羥基化，另一個O原子與2個質(zhì)子結(jié)合生成水。因此MMO的結(jié)構(gòu)表征，應(yīng)重點研究羥基化酶雙核鐵中心的氧化還原狀態(tài)，及其與催化功能和反應(yīng)機(jī)理的關(guān)系。MMOH的雙核鐵中心是底物和分子氧活化的位點，EXAFS、EPR、Mossbauer 和X光單晶街射數(shù)據(jù)均證明，MMOH的每個原體有一個雙核鐵活性中心。
(1) MMOH結(jié)構(gòu)的EXAFS譜學(xué)表征Prince[L17] 研究了Meth ylobacteri-ium sp. CRL-26菌MMOH的EAXFS譜，證明雙核鐵活性中心有一個μ氫氧橋(p-hydroxo) 或μ-氧橋(p-0xo)， 沒有一S配基存在。每個鐵有4~6個氧原子與之配位，鐵原子與配基的平均距離為(1.92士0.03)X10 10m, FeFe的距離為(3. 05士0.05)X 10-10m,半還原態(tài)MMOH的EPR信號gvv =1.85，然而由于該樣品的比活較低，在分離純化中只得到了兩個組分，缺少組分B,這就影響了表征數(shù)據(jù)的可靠性。Ericson[19]采用 EXAFS研究了Bath菌的半還原態(tài)羥基化酶，表明FeFe的距離為0.341nm,鐵與其配基(Fe-0/N)平均間距為0. 205nm.這一結(jié)果后來被Dewitt11]的EXAFS實驗所證實:Bath菌MMOH氧化態(tài)的Fe-Fe距離為0. 342nm,鐵與配基(Fe-O/N) 的平均間距為0.204nm。
(2) MMOH結(jié)構(gòu)的EPR研究Thomann[20]對 OB3b菌中MMOH的EPR研究表明，還原態(tài)、半還原態(tài)和氧化態(tài)的MMOH雙核鐵之間，均由y-OH橋連接。這很可能是還原態(tài)MMOH在氧化為氧化態(tài)時，保留了μ=-OH橋。采用低溫Y輻照還原后的MMOH樣品進(jìn)行EPR研究表明，半還原態(tài)MMOH的g2v=1.83, FeFe的間距為0. 341~0. 343nm。鐵與配基的平均間距從還原態(tài)時的0. 204nm,增加到0. 206 ~0.209nm,與鐵配位的主要是O/N基。通過能量飽和EPR研究測得，反鐵磁性交換偶合常數(shù)為J=一32cm-1.這些數(shù)據(jù)均表明，在半還原態(tài)MMOH活性中心有氫氧橋(hydroxo)、 烷氧橋(alkoxo)或羰基橋(earboxylato) 存在。綜合以上譜學(xué)研究數(shù)據(jù)可以認(rèn)為，Bath菌的MMOH活性中心結(jié)構(gòu)與02輸運(yùn)蛋白PAP、Hr、RR2的活性中心相似。半還原態(tài)MMOH樣品的ENDOR研究則表明，與鐵配位的兩個N來自于組氨酸配基，這兩個N直接結(jié)合到Fe?t原子上，與Fe2+的結(jié)合相對較弱。
Derose采用順磁譜研究了半還原態(tài)MMOH和小分子物質(zhì)的相互作用(gv=1.82)發(fā)現(xiàn)，加人甲醇等小分子底物后，MMOH的EPR譜發(fā)生明顯變化。在組分B存在下，羥基化酶EPR譜的g值發(fā)生位移，并顯示出能量飽和性，這充分反映出組分B對活性中心結(jié)構(gòu)的影響。從雙核鐵中心到MMOH表面的距離大約為1nm,組分B的存在可以改變天然酶活性中心的構(gòu)型，對催化反應(yīng)起調(diào)節(jié)作用。譜學(xué)表征結(jié)果補(bǔ)充了MMOH晶體結(jié)構(gòu)的研究數(shù)據(jù)，因為在液體狀態(tài)下，可以顯示酶的不同組分間和酶分子與其它小分子之間的相互作用。為了表征自然狀態(tài)下MMOH活性中心配位的靈活性，闡明反應(yīng)機(jī)理，并為不同來源的MMOH或其它雙核鐵蛋白提供譜學(xué)分析數(shù)據(jù)，Derose 等通過多核順磁技術(shù)(ENDOR, ESEEM),測定了活性中心未配對電子自旋的精確相互作用及核周圍超精細(xì)結(jié)構(gòu)的相互作用，提供了MMOH活性中心在反應(yīng)中可能發(fā)生的電子交換和幾何構(gòu)型信息。
(3) MMOH結(jié)構(gòu)的ENDOR譜學(xué)表征采用同位素 標(biāo)記與ENDOR譜測定相結(jié)合的方法，研究小分子物質(zhì)和酶活性中心的相互作用，是關(guān)聯(lián)活性中心結(jié)構(gòu)和反應(yīng)機(jī)理關(guān)系的有效方法。在X頻帶ENDOR譜研究中，半還原態(tài)MMOH的共振信號能反映組氨酸中1'N與Fe2+的配位。用H標(biāo)記的DMSO(二甲基亞砜)對MMOH進(jìn)行處理發(fā)現(xiàn)，可用ENDOR譜跟蹤DMSO和MMOH結(jié)合引起的Fe2+配位變化。有關(guān)ENDOR譜的一系列研究表明，甲醇等小分子是容易接近MMOH雙核鐵中心的，外來配基與MMOH的結(jié)合不是隨意的，而是具有選擇性。和MMOH結(jié)合的1.2H標(biāo)記的DMSO對μ=-OH橋和水配基有影響，采用14.15N標(biāo)記的組氨酸和MMOH結(jié)合則說明，外配基對2個組氨酸與MMOH活性中心配位雖然有干擾，但組氨酸和配位到Fe2+的水并沒有被取代，也沒有改變μ-OH橋;對1C、2H標(biāo)記的DMSO與MMOH活性中心結(jié)合的樣品進(jìn)行ENDER譜研究表明，半還原態(tài)MMOH的Fe3+有一個外露的配位點，或稱“易取代點”，在那里結(jié)合了DMSO.而Fe2+則表現(xiàn)得比較穩(wěn)定，不存在“易取代點”，DMSO的結(jié)合位點可能是0原子而不是Fe。這一事實合理地解釋了DMSO之所以能抑制甲烷氧化，是由于和水配位形成了第二個配位點。用H、9C標(biāo)記的DMSO處理MMOH樣品進(jìn)行ENDOR譜研究，補(bǔ)充并擴(kuò)展了Mossbauer 譜的研究結(jié)果。鬧明了DM-SO是直接結(jié)合到Fe原子上，還是以非共價鍵結(jié)合在疏水腔中，從而間接地描繪了O2、CH等小分子底物和產(chǎn)物在活性中心上的作用位點4.23。用PF、2H標(biāo)記的TFE (1,1.1-trifluoroethanol, 1.1.1-三氟乙醇) 和1.2H標(biāo)記的乙醇處理氧化態(tài)、半還原態(tài)的MMOH,進(jìn)行ENDOR譜研究證明，乙醇結(jié)合在半還原態(tài)MMOH的Fe2+和氧化態(tài)的羥基氧上。DMSO沒有影響甲醇和乙醇，卻替代了TEF在活性中心的結(jié)合位置。
從MMOH結(jié)構(gòu)推測酶催化機(jī)理模型
綜合MMOH的X射線單晶街射和EXAFS,EPR、ENDOR等譜學(xué)表征研究結(jié)果，半還原態(tài)的MMOH活性中心有四個潛在的底物和產(chǎn)物配位點，如圖3-9所示。位置2是可交換的羥基氧離子，水可結(jié)合在位置1或位置3, DMSO可結(jié)合在位置4, ENDOR譜實驗結(jié)果有力地支持了這一結(jié)論。后繼實驗又進(jìn)一步揭示，活性中心結(jié)合了甲醇以后，EPR信號由g≠1.940,1.865, 1. 740變?yōu)?.963, 1. 862，1. 740。同時乙酸基也可以直接結(jié)合到活性中心上，從而證實了甲烷的產(chǎn)物時甲醇是直接配位到活性中心的位置1或位置3上，在這四個位置可以同時結(jié)合DMSO、甲醇、水，而不相互競爭。這表明可以根據(jù)譜學(xué)表征結(jié)果推測出MMOH的催化機(jī)理模型。
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譜學(xué)表征研究還發(fā)現(xiàn)，在y射線的照射下，氧化態(tài)MMOH可被單電子輻射還原為半還原態(tài)MMOH,并且其結(jié)構(gòu)與化學(xué)還原的MMOH不同。這說明在化學(xué)還原過程中MMOH構(gòu)型會發(fā)生變化，而輻射單電子還原不會改變MMOH的構(gòu)型。Davydov 等首次報道了有關(guān)氧化態(tài)與半還原態(tài)MMOH可以相互轉(zhuǎn)化而不影響其構(gòu)型的直接證據(jù)。他們發(fā)現(xiàn)，在77K下，氧化態(tài)MMOH被Y射線單電子還原后，可轉(zhuǎn)化為具有順磁活性的半還原態(tài)MMOH,而基本保持了氧化態(tài)MMOH的構(gòu)型，也就是說，EPR譜學(xué)技術(shù)可以作為MMOH從氧化態(tài)轉(zhuǎn)化為半還原態(tài)結(jié)構(gòu)的探針。為了研究組分B對MMOH的影響，Davydov等采用y射線輻射還原MMOH,使之成為半還原態(tài)的MMOH,然后進(jìn)行EPR研究。結(jié)果表明，MMOB與小分子物質(zhì)如DMSO、甲醇一樣，也能使MMOH的雙核鐵活性中心發(fā)生構(gòu)型變化。這一結(jié)果與氧化還原電勢的研究結(jié)果致， 在甲醇、苯酚存在 下，MMOB對MMOH 有誘導(dǎo)變形作用。MMOB對MMOH的誘導(dǎo)變形是整個催化循環(huán)中的重要一步，它揭示了底物與酶的活性中心結(jié)合、轉(zhuǎn)化及產(chǎn)物釋放過程存在的位點。同樣，亮氨酸通道的打開、質(zhì)子轉(zhuǎn)移反應(yīng)、谷氨酸配基的羧基鍵位移等，也都和這種誘導(dǎo)變形作用有關(guān)。采用低溫輻射還原MMOH的EPR研究，間接提供了氧化態(tài)MMOH與小分子作用的重要信息。在無其它組分時，DMSO、甲醇對EPR譜基本沒有影響，而添加了MMOB之后有利于DMSO、甘油等小分子與活性中心結(jié)合，明顯干擾了氧化態(tài)MMOH與DMSO、甲醇等小分子化合物的EPR信號。而MMOB對化學(xué)還原的MMOH與小分子結(jié)合及變構(gòu)起抑制作用。這種細(xì)微的差別正是MMOB在催化反應(yīng)中對MMOH的調(diào)節(jié)作用，也說明氧化態(tài)、半還原態(tài)、還原態(tài)的MMOH對小分子物質(zhì)的反應(yīng)活性是不同的。CD、MCD譜的研究也表明，MMOB、底物、抑制劑與活性中心的結(jié)合可以改變還原態(tài)MMOH的構(gòu)型。同樣OB3b的MMOH表征結(jié)果也是如此，活性中心的雙核鐵問由pu-OH連接，MMOH三個不同的氧化還原態(tài)是相對穩(wěn)定的。Mossbauer、EPR譜顯示，氧化態(tài)MMOH中含有兩對相同的高自旋Fet,在半還原態(tài)時，EXAFS的研究進(jìn)一步證明oxo橋被質(zhì)子化，同樣，來自O(shè)B3b的高活性MMOH的Mossbauer, EPR31]譜研究也顯示，每分子中大約有兩個氫氧(hydrooxo) 橋連接的雙核鐵簇。大多數(shù)譜學(xué)研究對還原態(tài)的MMOH更有興趣，因為只有在還原態(tài)才能為分子氧提供電子使其發(fā)生裂解，將一個氧原子插入到底物中，而Fe本身變?yōu)檠趸瘧B(tài)，再從NADH得到電子，支持反應(yīng)循環(huán)。Hendrich 等進(jìn)行了MMOH的EPR研究，獲得一個低場信號g=16;而當(dāng)EPR信號有最大強(qiáng)度時，Mossbauer顯示僅有一個高自旋的(S= 2)Fe2+,表明被觀察的是一個完整的電子自旋系統(tǒng)。這與其它金屬蛋白研究結(jié)果類似，如脫氧蚯蚓血紅蛋白的疊氮化物，細(xì)胞色素C-P450氧化酶和一些模擬化合物。Fox 等 對來自O(shè)B3b的MMOH結(jié)構(gòu)研究結(jié)果有所不同，他們通過EPR研究認(rèn)為，氧化態(tài)的MMOH中鐵沒有直接與pμ-oxo橋相連，這與EXAFS的研究結(jié)果一致，在光譜中未發(fā)現(xiàn)pμ-oxo 橋的短Fe O鍵特征。值得一提的是氧化態(tài)的交換偶合強(qiáng)度(J= 15cm-1)比半還原態(tài)(J=60cm~1)弱，因為Fe3+與Fe8+的相互作用比Fe8+與Fe2+要強(qiáng)，說明MMOH在還原過程中有一個構(gòu)型重排過程。在MeySO,或甲醇存在下，半還原態(tài)MMOH的EPR信號發(fā)生改變，主要是由于活性中心的配位變化所致，這與ENDOR分析結(jié)果是一致的。組分B的結(jié)合，減少了交換偶合，使:值移動減小，這是由于在組分B存在下，反應(yīng)循環(huán)中產(chǎn)物的結(jié)合，使分子構(gòu)型或雙核鐵間連接橋的化學(xué)性質(zhì)發(fā)生了變化。Fox和Liu等的研究也證實，組分B的加人改變了MMOH的EPR譜，可以使MMOH的反應(yīng)速率增加1000倍左右。
沒有NADH提供電子，MMOH只能催化甲燒的單循環(huán)氧化反應(yīng)。如果雙核鐵中心被非生物催化還原，或不采用分子氧而以H2O2作為氧源，其它兩個組分(MMOB, MMOR)不存在，反應(yīng)也可以進(jìn)行，但反應(yīng)動力學(xué)和其它催化性質(zhì)會明顯改變。MMOR和NADH能有效和活性中心結(jié)合并向MMOH提供電子，MMOB可以使MMOH結(jié)構(gòu)發(fā)生誘導(dǎo)變形，把分子氧與雙核鐵中心的反應(yīng)速率提高1000倍，都充分說明MMOB、MMOR在完成酶催化反應(yīng)循環(huán)中起著不可替代的作用。對氧化態(tài)、半還原態(tài)MMOH進(jìn)行CD、MCD研究和EPR結(jié)果一樣，也都說明MMOB與MMOH的結(jié)合會引起雙鐵核中心構(gòu)型變化; Pulver等進(jìn)行的CD研究顯示，底物為反-1,2-二氯乙烯、四氯乙烯，在MMOB存在下可誘導(dǎo)MMOH構(gòu)型改變;而MCD研究表明，這種構(gòu)型變化并未改變活性中心鐵的配位狀況。CD、MCD提供了一種對非血紅素雙核鐵活性中心的直接檢測方法。因為它可以探測Fe2+的de-d配基轉(zhuǎn)換，并進(jìn)一步觀察配基的轉(zhuǎn)化，而在近紅外吸收光譜中，蛋白質(zhì)、緩沖液的擾動信號是很弱的?？勺儨囟取⒆儓龅腗CD(VTVH-MCD)能用來評價基態(tài)、激發(fā)態(tài)二聚體亞基能級分裂和8n值。其結(jié)果可以用含亞鐵離子的能級分裂，并結(jié)合配位鍵雙鐵核中心交換偶合的哈密頓函數(shù)來解釋。還原態(tài)MMOH的CD、MCD研究則顯示，MMOH含有2個被扭曲了的5配位Fe,呈現(xiàn)不同幾何形狀。VTVH-MCD研究顯示，在基態(tài)有一個ge=14.7,需要2個鐵磁性偶合(J-0.3~0. 5em-))的亞鐵，每個鐵的負(fù)零場分裂產(chǎn)生一個Sur = 4,M,=士4的基態(tài)。添加了小分子陰離子、酶的底物、產(chǎn)物、抑制劑后，CD光譜不改變。這說明這些小分子未直接結(jié)合到Fe原子或連接到鐵活性中心上，而加入超過2倍量的MMOB后，CD和MCD光譜有明顯變化。然而，VTVHMCD和自旋哈密頓函數(shù)并未明顯改變，說明來自O(shè)B3b的MMOH活性中心比其它雙核鐵蛋白的親電子性弱。根據(jù)CD、MCD譜的研究結(jié)果進(jìn)行配位分析表明，MMOB只與2個Fet中的一個結(jié)合，并誘導(dǎo)其活性中心產(chǎn)生了幾何構(gòu)型的明顯改變。也就是說被擾動的那個Fe2t,才有可能在催化分子氧的活化反應(yīng)中起關(guān)鍵作用。
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