液相色譜分辨率
抖化學 / 2022-09-17
高效液相色譜是色譜法的一個重要分支，以液體為流動相，采用高壓輸液系統(tǒng)，將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動相泵入裝有固定相的色譜柱，在柱內(nèi)各成分被分離后，進入檢測器進行檢測，從而實現(xiàn)對試樣的分析。HPLC分離基于溶質(zhì)在流動相和固定相之間的分配，涉及的參數(shù)較多，例如，溶質(zhì)的物理化學性質(zhì)和分子量；流動相的性質(zhì)、組成、溫度、pH值和流速；以及固定相的化學性質(zhì)和尺寸會影響分離質(zhì)量（保留時間、選擇性、效率、壓降、峰面積）。弄清個中關系還是比較困難的。我將用最簡單簡潔的語言，講明白其中的邏輯。
分辨率
兩個相鄰譜帶之間的分離度稱為分辨率Rs,其定義為兩譜帶中心之間的距離除以同一單位表示的譜帶平均寬度，即
VR2 -VR1
Rs=2(-------------------)(以體積表示)
ω1+ω2
或
tR2-TR1
Rs=2(-------------------)(以時間單位表示)
ω1+ω2
從峰的轉(zhuǎn)折點所引切線與基線相交求得ω(見圖1-1 )。因為對于兩個剛好分開的譜帶，ω1≈ω2和σ1≈σ2, 方程( 1-23a )簡化為
⊿VR
Rs≈--------------
ω
又因為對于一個給定的譜帶，ω2 等于4倍標準偏差(σ2)，方程 1-23b )簡化為
tR2-tR1
Rs≈----------------
4σ2
當Rs=1.5時，相鄰譜帶接近于完全分離，重疊少于1% (6σ分離)。
當Rs=1時譜帶之間的重疊等于4σ,但兩個峰的存在已易于辨認。然而當Rs進一步減小時，則兩個譜的存在就變得較難識別，尤其當兩個譜帶大小不等時更難區(qū)分。這種影響用圖解表示于圖1-5。
圖1-5不同分辨率Rs和峰的大小不同時得到的分離度和峰形
分辨率的方程式
Rurneu指出,將用譜帶寬度和譜帶中心距離表示分辨率的簡單方程轉(zhuǎn)換為采用更基本的參數(shù)表示，就能得到關于支配分辨率的各種因素的更多的信息。
分辨率方程式(1-23)可用方程(1-20)轉(zhuǎn)換成
在此可引入分離因子(選擇性因子)a
k’2 k’2
a=---------=---------
k1 k1
即a是容量因子比，或更切實地說是分配系數(shù)比。將負引進方程(1-25)可得
這樣就可看到分辨率是三個因子的函數(shù):柱效率N,分離因子a和容量因子k’。方程( 1-27 )在色譜中是一一個極重要的關系式，因為它把三個重要的參數(shù)和它們對分辨率的影響聯(lián)系起來。而且應該記住，作為初步近似，這三個參數(shù)可以獨立地變化，因此考慮這三個變數(shù)對分辨率的影響是有啟發(fā)性的。
N只是一個純數(shù)字，但它與柱的動力學有關(見第2章)，可由改變色譜床的長度，變化顆粒的大小，增減流動相的速度而變化。于是，可以增大N的任何柱子結構的改善，也能增大Rs;但要記住，這是平方根的關系，即假如N從100增加至625理論塔板，分辨率僅增加到2.5倍，而不是6.25倍。a和k'是溶質(zhì)一-溶劑一溶劑相互作用的函數(shù)，或者說是色譜系統(tǒng)的熱力學，而a和k的變化是由改變柱中固定相與流動相之比，選擇不同的相體系，以及調(diào)節(jié)溫度等等來完成。
于是，當a≥1時，(a- 1)/a的值從0到1(a很大時),即當a=1時不可能分離，但只要a略大于1就對分辨有很大的作用，當a=2.0時，兩個組分的分離應是易于完成的。
k'也能對分離具有深刻的影響，k'在高值時k'/(1+k' )-→1。這可能使人想到k’值應該高，但如果時間對分析來說是重要的話，情況就并非如此了。高的k’值導致非常長的保留時間，同時譜帶寬闊而稀釋，難以檢測。情況表明，如要獲得合理的分析時間，k’不應比5大很多。
因此，當利用分辨方程以使給定的分離最佳化時，首先要調(diào)整的因子是k'，k'值在1.5和5之間(見下文)是一種合理的折衷，此時分離時間增加不多[5、6 ].其次，選擇N以提供與合理的分析時間相協(xié)調(diào)的最高柱效率，但如分離仍成問題，則可改變流動相的組成以改變a，從而使固定相具有更大的選擇性。
液相色譜基本原理是分離度(也叫分辨率)正比于
四分之理論塔板數(shù)n的平方根乘以
選擇因子a比上a-1再乘以
分離因子k+1比上k
我認為分離度和這些變量是正比關系而不是準確的等于，如果非要說是等于的關系，再加上一個常數(shù)可能會更合理。
n和柱長(正比)、粒徑(反比)、固定項填料(全多孔硅膠型，表面多孔/核殼型)有關
a和流動相種類(反向色譜：甲醇和乙腈)、pH(2到9)、柱溫有關
分離因子/保留因子(平衡狀態(tài)下，固定相中含量與流動相中的比值)和流動相種類、流動相比例、柱溫、固定相填料有關.
在遇見液相色譜儀哪些異常情況？又是如何解決的？
主要是：峰的問題：峰前沿，峰重疊，峰拖尾，鬼峰，基線漂移。壓力問題：超壓，低壓，壓力波動。硬件問題：日常損耗，零件損壞。
液相色譜的主要部件有哪些？
液相色譜的部件，我以我使用過的安捷倫為例吧！按流動相流路的順序：流動相→真空脫氣機(在線脫氣裝置)→泵(二元泵和四元泵：區(qū)分，有幾種流動相按一定比例混合)→進樣器(手動和自動)→柱溫箱→檢測器(紫外：朗伯-比爾定律，質(zhì)譜：荷質(zhì)比，熒光：躍遷，elsd：蒸發(fā)光)
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