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 L-色氨酸

 

中文名稱     L-色氨酸

中文同名     L-氨基吲哚丙酸;L-胰化蛋白氨基酸

英文名稱     L-Tryptophan

化學(xué)式        C11H12N2O2

分子量        204.23

CAS編號(hào)    73-22-3

質(zhì)檢信息

質(zhì)檢項(xiàng)目       指標(biāo)值

含量,％         ≥99%

PSA：          79.11000

LOGP：       1.82260

比旋   31.5  (c=1, H2O 24 C) 

沸點(diǎn) 342.72°C (rough estimate) 

密度 1.1754 (rough estimate) 

折射率 31 ° (C=1, H2O)ChemicalBook

化學(xué)特性

1.L-色氨酸為白色結(jié)晶性粉末。 無臭、味微苦， 在水中微溶（1.14%, 25℃), 難溶于乙醇。 可溶于稀酸或稀堿。

產(chǎn)品用途

1.氨基酸類藥。 用于氨基酸輸液。 常與鐵劑、維生素等合用， 與VB6合用改善抑郁癥， 防治粗皮??； 作為失眠鎮(zhèn)靜劑配合L-多巴用于治療帕金森氏病。對實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有致癌性； 有惡心、厭食、哮睡等不良反應(yīng)。 忌與單胺氧化酶抑制劑合用。

2.營養(yǎng)增補(bǔ)劑。 蛋清蛋白、魚肉、玉米粉等所含色氨酸為限制氨基酸，大米等谷物中含量較少?？膳c賴氨酸、蛋氨酸、蘇氨酸合用于強(qiáng)化氨基酸。按0.02%的色氨酸和0.1%的賴氨酸添加于玉米制品，可顯著提高蛋白質(zhì)效價(jià)。

3.L-色氨酸用于生化研究，醫(yī)藥上用作鎮(zhèn)靜劑。

4.改善營養(yǎng)、增強(qiáng)體質(zhì)。

5.在色氨酸取代的Sephadex? 以及Sepharose?中的血清素與褪黑素的前體，用于改進(jìn)的纖維素酶色譜分離；作為血清蛋白等速電泳法中的間隔片，滿足各種各樣微生物的生長要求

 

儲(chǔ)藏措施

1.儲(chǔ)存于陰涼、通風(fēng)的庫房。

2.應(yīng)與氧化劑、食用化學(xué)品分開存放，切忌混儲(chǔ)。

3.保持容器密封。      

4.遠(yuǎn)離火種、熱源，防止陽光直射。

5.庫房必須安裝避雷設(shè)備。

6.排風(fēng)系統(tǒng)應(yīng)設(shè)有導(dǎo)除靜電的接地裝置。

7.采用防爆型照明、通風(fēng)設(shè)置。

8.禁止使用易產(chǎn)生火花的設(shè)備和工具。

9.儲(chǔ)區(qū)應(yīng)備有泄漏應(yīng)急處理設(shè)備和合適的收容材料。

10.防止粉塵和氣溶膠生成。

急救措施 

【食入】攝入不可能。但是，如果攝入，獲得緊急醫(yī)療照顧。

【吸入】如果克服被曝光，將受害人轉(zhuǎn)移到空氣新鮮處。給予吸氧或人工呼吸。獲得緊急醫(yī)療照顧。迅速采取行動(dòng)是至關(guān)重要的。

【皮膚】立即脫去污染的衣著。徹底清洗皮膚，用溫和的肥皂/水。W /溫水沖洗15分鐘。如果是粘的，首先使用無水清潔。尋求醫(yī)療照顧，如果不良影響或刺激。

【眼睛】眼睛接觸的情況下，立即用清水沖洗20-30分鐘。經(jīng)常收回眼皮。獲得緊急醫(yī)療照顧。

生產(chǎn)方法 

以DL-色氨酸為原料，冷卻狀態(tài)下加入氯乙酸酐反應(yīng)，經(jīng)硫酸酸化后在冰水中研磨，過濾后水中重結(jié)晶，最后用胰羧肽酶處理，除去D-型，乙酸酸化、乙醇重結(jié)晶精制而得。

合成法 由合成法制得DL-色氨酸后，再經(jīng)旋光拆開法制得。 由干酪素經(jīng)胰酶分解而得。

L-色氨酸的制備可采用前體添加法生產(chǎn)， 以葡萄糖為碳源和能源， 添加前體鄰氨基苯甲酸或吲哚進(jìn)行培養(yǎng)， 將前體轉(zhuǎn)化為L-氨基酸； 其二可采用酶法生產(chǎn)； 其三可采用化學(xué)合成法

其四可采用蛋白質(zhì)水解法等。 下面詳細(xì)介紹血纖蛋白酶水解法生產(chǎn)L-色氨酸。 工藝過程 血纖蛋白[蛋白酶、甲苯、氯仿]→[45℃, 酶水解]水解濾液[多孔H型樹脂]→吸附[0.3mol/L氨水]→[洗脫]洗脫液[濃縮、結(jié)晶]→[冰箱中，24h]L-色氨酸粗品[65%乙醇重結(jié)晶]→L-色氨酸成品 酶水解 首先將血纖蛋白25kg, 加蒸餾水37.5kg。 加熱使其變性， 甩干搓散后投入水解罐中， 加蒸餾水40-45L， 攪拌， 加熱至45℃, 然后按序加入一定量的蛋白酶或指定物質(zhì)， 保溫45℃， 并控制好溶液pH值， 水解時(shí)間， 以求使蛋白完全水解， 而提高氨基酸收率。 先加入25g 3942 中性蛋白酶及175g 1398 中性蛋白酶， 甲苯和氯仿各2590ml, 每間隔半小時(shí)攪拌10min， 用Ca(OH)2懸浮液調(diào)控溶液pH值7.0-7.2, 48h后再加入175g 166酶制劑， 水解8h， 再加腎勻漿（內(nèi)含氯化錳40g), 調(diào)控pH值7.5-8.0， 維持40h。 然后再加NaHSO3 110g, 以12mol/L的H2SO4調(diào)pH值5.0, 保溫80℃ 20min， 最后過濾， 其濾渣用水洗滌2次， 洗液與濾液合并得水解液。 吸附洗脫 將水解液置于冰箱中， 保持0℃， 靜置24h, 過濾除去沉降物， 取濾液以等體積水稀釋， 讓其通過裝有多孔型陽離子交換樹脂柱， 水解液中的氨基酸被吸附， 檢查流出液當(dāng)有色氨酸反應(yīng)時(shí)停止上柱， 先用水洗柱， 再用0.3mol/L的氨水洗脫，收集洗脫液，至流出的洗脫液pH=12或檢查無色氨酸時(shí)停止洗脫。 濃縮、結(jié)晶 將洗脫液減壓濃縮至有結(jié)晶析出時(shí)， 冷卻降溫至0℃， 靜置24h, 過濾取結(jié)晶， 用65%與95%乙醇先后洗滌結(jié)晶， 得色氨酸粗品。 母液再調(diào)pH至6.0, 又有結(jié)晶析出， 靜置24h， 過濾取結(jié)晶， 同上述方法洗脫結(jié)晶， 合并兩次粗品， 60℃真空干燥色氨酸粗品。 重結(jié)晶精制 將上述粗品用65%乙醇溶液重結(jié)晶2次， 并用95%乙醇液洗滌1次， 真空干燥8h， 得L-色氨酸成品。

一種L-色氨酸的發(fā)酵工藝的制作方法

L-色氨酸的分子式為C11H12O2N2，分子量為204.21，含氮13.72％。L-色氨酸是含有吲哚基的中性芳香族氨基酸，呈絹絲光澤、六角片狀自色晶體，無臭，有甜味水中溶解度1.14g/L(25℃)溶于稀酸或稀堿，在堿液中較穩(wěn)定，強(qiáng)酸中分解，微溶于乙醇，不溶于氯仿、乙醚。L-色氨酸是人體和動(dòng)物生命活動(dòng)中八種必需的氨基酸之一，對人和動(dòng)物的生長發(fā)育、新陳代謝起著重要的作用，被稱為第二必需氨基酸，它是繼蛋氨酸和賴氨酸之后的第三大飼料添加氨基酸，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品和飼料行業(yè)。

近年來，隨著國內(nèi)飼料工業(yè)的發(fā)展和L-色氨酸及其代謝產(chǎn)物研究的深入，尤其是隨著我國老齡化程度不斷加重，L-色氨酸在醫(yī)藥行業(yè)上的用途也不斷擴(kuò)大。目前，L-色氨酸逐漸成為一種國際市場發(fā)展?jié)摿薮蟆鴥?nèi)市場需求較大的產(chǎn)品。

目前，L-色氨酸的生產(chǎn)方法主要有4種：(1)蛋白質(zhì)水解法：主要從含有相對豐富的L-色氨酸的廢蠶絲、毛發(fā)和血粉等蛋白質(zhì)原料通過酶水解或堿水解法來提取L-色氨酸。蛋白質(zhì)水解法工藝復(fù)雜，生產(chǎn)周期長，產(chǎn)品成分復(fù)雜，現(xiàn)在使用較少。(2)化學(xué)合成法：化學(xué)合成主要以苯阱為原料或者以吲哚為原料合成，合成之后為DL-色氨酸，在經(jīng)過拆分得到L-色氨酸。這種方法原料成本高，工藝復(fù)雜，工業(yè)推廣差。(3)酶促轉(zhuǎn)換法：利用微生物產(chǎn)生的L-色氨酸合成酶系轉(zhuǎn)化前體合成L-色氨酸的方法。此法L-色氨酸合成酶受吲哚影響較嚴(yán)重，底物L(fēng)-絲氨酸價(jià)格較高，吲哚水溶性較差，轉(zhuǎn)化率不高。(4)發(fā)酵法：是指利用L-色氨酸高產(chǎn)菌種，采用葡萄糖等廉價(jià)碳源做原料，控制合適的發(fā)酵條件，從而獲得L-色氨酸產(chǎn)品的一種方法。發(fā)酵法已經(jīng)成為當(dāng)前工業(yè)生產(chǎn)L-色氨酸最重要的方法。申請人之前的專利技術(shù)“一種工業(yè)化發(fā)酵高產(chǎn)L-色氨酸的方法”采用兩種菌株混合發(fā)酵的方式，產(chǎn)酸率較單一菌株提高，但是存在培養(yǎng)工藝復(fù)雜、參數(shù)難以控制等缺陷。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明需要解決的實(shí)際技術(shù)問題是，克服現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，提供了一種L-色氨酸的發(fā)酵工藝。

本發(fā)明的目的是通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的，

一種L-色氨酸的發(fā)酵工藝，其包括如下步驟：步驟1)制備L-色氨酸發(fā)酵液，步驟2)菌株二次處理，步驟3)合并提取L-色氨酸。

具體地，所述發(fā)酵工藝包括如下步驟：

步驟1)制備L-色氨酸發(fā)酵液：將產(chǎn)L-色氨酸的大腸桿菌培養(yǎng)至濃度為1×107cfu/mL的種子液，然后按照6-8％(v/v)接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，控制發(fā)酵溫度36℃，溶氧控制20％，罐壓為0.05MPa，并通過流加濃度為100g/L的葡萄糖溶液將殘?zhí)强刂圃诓坏陀?.0％，通過流加氨水控制在pH為6.8-7；發(fā)酵至30h停止，得到L-色氨酸發(fā)酵液；

步驟2)菌株二次處理：利用高速碟片分離機(jī)離心處理L-色氨酸發(fā)酵液，收集上層料液和濕菌體分離；往濕菌體中添加1-2wt％電氣石粉，100rpm攪拌10-15min，然后停止攪拌，加熱至53-55℃，保溫1-2min，自然冷卻至室溫，然后添加到三倍重量的透析培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度36℃，100rpm攪拌培養(yǎng)4-6h，無機(jī)陶瓷膜過濾收集菌體和濾液；

步驟3)合并提取L-色氨酸：將步驟2)所得上層料液和濾液合并，用于提取L-色氨酸。

優(yōu)選地，

所述發(fā)酵培養(yǎng)基組分為：葡萄糖20g/L、玉米漿10g/L、硫酸銨5g/L、磷酸氫二鉀2g/L、磷酸二氫鉀2g/L、硫酸鎂1.5g/L、檸檬酸1.5g/L、硫酸亞鐵70mg/L、硫酸鈉20mg/L、硫酸錳7mg/L、硫酸鋅7mg/L、氯化鈷6mg/L、硫酸銅0.9mg/L。

優(yōu)選地，

所述透析培養(yǎng)基為(質(zhì)量百分比)：磷酸二氫鉀1.0％，磷酸氫二鉀1.0％，硫酸銨0.5％，聚乙二醇0.06％，硫酸亞鐵0.01％，硫酸錳0.01％，硫酸鎂0.01％。

優(yōu)選地，

所述無機(jī)陶瓷膜的膜孔徑50nm。

優(yōu)選地，

所述高速碟片機(jī)的離心轉(zhuǎn)速為3000rpm，離心時(shí)間為5min。

本發(fā)明取得的有益效果主要包括但是并不限于以下幾個(gè)方面：

本發(fā)明針對發(fā)酵工序的進(jìn)行改進(jìn)，避免L-色氨酸濃度積累到引起反饋抑制，針對發(fā)酵后的廢棄菌體進(jìn)行二次產(chǎn)酸處理，增加了細(xì)胞膜的通透性，提高了菌株的產(chǎn)酸能力，發(fā)酵周期大大延長；

適當(dāng)時(shí)間和溫度的熱處理可以提高菌株的產(chǎn)酸能力以及細(xì)胞膜通透性，配合透析培養(yǎng)基，使得L-色氨酸的產(chǎn)率大大提高；

電氣石能夠自動(dòng)釋放負(fù)離子，負(fù)離子具有較強(qiáng)的氧化性，還持續(xù)發(fā)生直流靜電，釋放礦物質(zhì)和微量元素，對菌株繁殖起促進(jìn)作用；本發(fā)明采用透析培養(yǎng)基對菌株進(jìn)行培養(yǎng)，能改變細(xì)胞的生物膜結(jié)構(gòu)，促進(jìn)物質(zhì)的利用和轉(zhuǎn)運(yùn)，同時(shí)使L-色氨酸積累引起的反饋抑制調(diào)節(jié)大大降低，產(chǎn)酸效率提高，而且后續(xù)的殘?zhí)巧伲粫?huì)造成菌株黏著絮凝成團(tuán)，有利用后續(xù)的膜過濾分離。

說明書附圖

圖1：電氣石粉添加量對L-色氨酸含量的影響。

具體實(shí)施方式

為了使本技術(shù)領(lǐng)域的人員更好地理解本申請中的技術(shù)方案，下面將結(jié)合本申請具體實(shí)施例，對本發(fā)明進(jìn)行更加清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本申請一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例。基于本申請中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有作出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都應(yīng)當(dāng)屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。

實(shí)施例1

一種L-色氨酸的發(fā)酵工藝，其包括如下步驟：

將大腸桿菌CCTCC M 2011316培養(yǎng)至濃度為1×107cfu/mL的種子液，然后按照6％(v/v)接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基(葡萄糖20g/L、玉米漿10g/L、硫酸銨5g/L、磷酸氫二鉀2g/L、磷酸二氫鉀2g/L、硫酸鎂1.5g/L、檸檬酸1.5g/L、硫酸亞鐵70mg/L、硫酸鈉20mg/L、硫酸錳7mg/L、硫酸鋅7mg/L、氯化鈷6mg/L、硫酸銅0.9mg/L)中，控制發(fā)酵溫度36℃，溶氧控制20％，罐壓0.05MPa，并通過流加濃度為100g/L的葡萄糖溶液將殘?zhí)强刂圃诓坏陀?.0％，通過流加氨水控制在pH為6.8；發(fā)酵至30h停止，得到L-色氨酸發(fā)酵液；

利用高速碟片分離機(jī)離心處理L-色氨酸發(fā)酵液，收集上層料液和濕菌體分離；高速碟片機(jī)的轉(zhuǎn)速為3000rpm，時(shí)間為5min；往濕菌體中添加1.5wt％電氣石粉，100rpm攪拌15min，然后停止攪拌，加熱至53℃，保溫2min，自然冷卻至室溫，然后添加到三倍重量的透析培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度36℃，100rpm攪拌培養(yǎng)6h，無機(jī)陶瓷膜過濾收集菌體和濾液；所述透析培養(yǎng)基為(質(zhì)量百分比)：磷酸二氫鉀1.0％，磷酸氫二鉀1.0％，硫酸銨0.5％，聚乙二醇0.06％，硫酸亞鐵0.01％，硫酸錳0.01％，硫酸鎂0.01％，調(diào)整pH為6.8；所述無機(jī)陶瓷膜的膜孔徑50nm；

將上層料液和濾液合并，用于提取L-色氨酸。

一種高效發(fā)酵生產(chǎn)l-色氨酸的方法

[0001]本發(fā)明涉及一種L-色氨酸的生產(chǎn)方法，具體說，是涉及一種以高產(chǎn)率制備高效發(fā)酵的L-氨基酸生產(chǎn)方法。

【背景技術(shù)】

[0002]L-色氨酸的生產(chǎn)方法先后經(jīng)歷了蛋白質(zhì)水解法、化學(xué)合成法和微生物法三種方法，其中微生物法又包括直接發(fā)酵法、微生物轉(zhuǎn)化法和酶法。隨著基因組學(xué)和代謝組學(xué)研究的不斷深入，人們將重組DNA技術(shù)應(yīng)用在微生物育種和酶工業(yè)上，從而極大地推動(dòng)了直接發(fā)酵法和酶法生產(chǎn)L-色氨酸的工業(yè)化進(jìn)程。直接發(fā)酵法原材料簡單、成本低、質(zhì)量好、環(huán)保處理費(fèi)用低，具有較大的優(yōu)勢。目前國內(nèi)外的眾多科研院所和企業(yè)紛紛利用這類技術(shù)提高L-色氨酸的發(fā)酵水平，完成了一系列基因工程菌的構(gòu)建，大大提高了發(fā)酵單位。例如，日本協(xié)和發(fā)酵的Ikeda等人利用申請專利的基因工程重組菌生產(chǎn)L-色氨酸，專利號(hào):US5447857。其菌種產(chǎn)能達(dá)到35.2g/L發(fā)酵液(2升罐小試)，放大后發(fā)酵單位達(dá)到66g/L。

[0003]目前，L-色氨酸發(fā)酵企業(yè)大多采用分批補(bǔ)料發(fā)酵方式。這種方式對發(fā)酵液中殘留葡萄糖濃度控制和補(bǔ)入糖(包括葡萄糖和液糖)的分散程度要求較高。殘留葡萄糖濃度若要控制的不當(dāng)，就會(huì)影響到菌體的正常代謝，使菌體的代謝途徑發(fā)生變化，嚴(yán)重影響L-色氨酸的發(fā)酵水平和產(chǎn)量，甚至?xí)?dǎo)致無L-色氨酸產(chǎn)生。補(bǔ)入糖的分散程度也會(huì)影響到L-色氨酸發(fā)酵水平，現(xiàn)有設(shè)備由于只使用單一的管道進(jìn)料，就使得糖在發(fā)酵液中不能迅速均勻分布，造成局部濃度過高，引起此處菌體代謝異常，產(chǎn)生對菌體生成色氨酸不利的代謝產(chǎn)物，同時(shí)發(fā)酵液中得不到糖的菌體產(chǎn)生L-色氨酸能力受限。所以，殘?zhí)堑目刂扑胶吞悄芊裨诎l(fā)酵液中快速均勻分布對L-色氨酸的發(fā)酵水平起著至關(guān)重要的作用。

[0004]培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)對菌體的生長和代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生起著決定作用?，F(xiàn)行L-色氨酸發(fā)酵培養(yǎng)基中各組分限制了 L-色氨酸產(chǎn)生菌株的生長和L-色氨酸發(fā)酵水平的進(jìn)一步提聞。`

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有生產(chǎn)工藝中發(fā)酵單位偏低、發(fā)酵周期較短、成本較高的問題，通過對發(fā)酵設(shè)備進(jìn)行改造、發(fā)酵培養(yǎng)基配方與發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化，從而發(fā)明了一種高效發(fā)酵生產(chǎn)L-色氨酸的方法。本發(fā)明在不增加任何額外設(shè)備和人力投入的情況下，延長了發(fā)酵周期，降低了勞動(dòng)強(qiáng)度，大幅度的提高了發(fā)酵單位，降低了生產(chǎn)成本。

[0006]本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn):

[0007]一種高效發(fā)酵生產(chǎn)L-色氨酸的方法，包括種子培養(yǎng)和采用L-色氨酸發(fā)酵補(bǔ)糖裝置將補(bǔ)入糖均勻分布并進(jìn)行高效發(fā)酵培養(yǎng)的生產(chǎn)過程。

[0008]補(bǔ)入糖可以為口服葡萄糖，也可以為液糖，本發(fā)明中涉及的葡萄糖均可以用相同葡萄糖含量的液糖代替。

[0009]作為一種優(yōu)選方案，所述的種子培養(yǎng)過程包括如下步驟:[0010]配制種子培養(yǎng)基，將菌種接入種子培養(yǎng)基中，接種量為0.1~5% v/v，在罐溫20~40°C，pH6.5~7.5，溶解氧60%以上于500~2000L種子罐中培養(yǎng)至對數(shù)生長期的末期，600nm吸光度值10~30，制得種子液。

[0011]作為進(jìn)一步優(yōu)選方案，所述種子培養(yǎng)基配方為:葡萄糖2.0~5.0 %，磷酸氫二鈉0.2~L 5%，蛋白胨0.1~L 0%，氯化鎂0.1~L 0%，檸檬酸三鈉0.10~0.50%，硫酸亞鐵0.0001~0.001%，硫酸錳0.0001~0.001%,以上均為重量百分比，滅菌前NaOH調(diào)節(jié)pH值為6.5~7.5。

[0012]作為一種優(yōu)選方案，所述的采用L-色氨酸發(fā)酵補(bǔ)糖裝置將補(bǔ)入糖均勻分布以進(jìn)行高效發(fā)酵培養(yǎng)生產(chǎn)過程包括如下步驟:

[0013]a)配制發(fā)酵培養(yǎng)基；

[0014]b)制得的種子液以1.0~20% v/v的接種量接種發(fā)酵罐進(jìn)行發(fā)酵；

[0015]c)發(fā)酵過程中通過調(diào)節(jié)發(fā)酵罐的攪拌轉(zhuǎn)速和空氣流量將溶解氧控制在一定的水平上；

[0016]d)用氨水將pH自動(dòng)控制在6.5~7.5 ;

[0017]e)流加葡萄糖含量60~70% w/v (重量體積百分比)的糖并采用糖分布組件,使補(bǔ)入的糖快速在發(fā)酵罐中分布均勻，并將殘留葡萄糖控制在0.1% w/v(重量體積百分比)以下；

[0018]f)全部發(fā)酵進(jìn)行到40~60h結(jié)束。

[0019]作為進(jìn)一步優(yōu)選方案，所述發(fā)酵過程中發(fā)酵罐培養(yǎng)溫度為20~40°C，罐壓0.02~0.06MPa,空氣流量1: 0.5~1: L 5vvm，攪拌轉(zhuǎn)速70~lOOrpm。

[0020]作為進(jìn)一步優(yōu)選方案，所述發(fā)酵過程中溶解氧控制方法為:在溶解氧回升前，通過調(diào)整攪拌轉(zhuǎn)速和空氣流量將溶氧控制在40%以上，溶解氧回升后按照固定的時(shí)間間隔提高攪拌轉(zhuǎn)速(以10~12rpm的速率提高)或空氣流量(最高提高到1: 1.5vvm)，同時(shí)提高補(bǔ)糖速率，發(fā)酵罐O~12h溶解氧控制在40%~60%之間，13h~結(jié)束培養(yǎng)溶解氧控制在30%~50%之間。

[0021]作為進(jìn)一步優(yōu)選方案，所述發(fā)酵過程中殘留葡萄糖控制方法為:從發(fā)酵接種開始，每隔4h取樣，采用葡萄糖測定儀對發(fā)酵罐發(fā)酵過程中發(fā)酵液中的殘留葡萄糖進(jìn)行測定，該測定儀使用具有高度專一性的葡萄糖氧化酶膜，根據(jù)測定結(jié)果確定合適的補(bǔ)糖速率，高于0.1%則降低補(bǔ)糖速率，低于0.1%則增加補(bǔ)糖速率，從而將發(fā)酵液中殘留葡萄糖控制在0.1 % w/v 以下。

[0022]作為進(jìn)一步優(yōu)選方案，為實(shí)施本方法專門設(shè)計(jì)了一種L-色氨酸發(fā)酵補(bǔ)糖裝置，主要包括發(fā)酵罐本體、糖輸送主管道和至少一個(gè)糖分布組件，其中所述糖輸送主管道位于發(fā)酵罐本體上方，從外向內(nèi)穿入發(fā)酵罐本體內(nèi)，其中所述糖分布組件活動(dòng)連接在糖輸送主管道的末端，貫穿所述發(fā)酵罐本體內(nèi)部。

[0023]作為更進(jìn)一步優(yōu)選方案，所述糖分布組件主要由糖輸送分管道和其末端做成環(huán)形的多孔分布管構(gòu)成，所述糖輸送分管道上端活動(dòng)連接糖輸送主管道的末端；所述多孔分布管管體上和末端設(shè)有出料孔，管體上出料孔呈不均勻分布，工作時(shí)糖會(huì)依次通過糖輸送主管道，輸送分管道，多孔分布管的出料孔進(jìn)入發(fā)酵罐中，使糖在發(fā)酵罐中均勻分布。

[0024]作為進(jìn)一步優(yōu)選方案，所述多孔分布管上出料孔呈不均勻分布的方式為距離糖輸送分管道越遠(yuǎn)，設(shè)置越密。

[0025]作為進(jìn)一步優(yōu)選方案，所述糖輸送主管道與糖輸送分管道的活動(dòng)連接為卡環(huán)連接。

[0026]作為進(jìn)一步優(yōu)選方案，所述糖輸送主管道上活動(dòng)連接有蒸汽滅菌管道，蒸汽可以通過該管道直接進(jìn)至糖輸送主管道和分布組件。

[0027]作為進(jìn)一步優(yōu)選方案，發(fā)酵罐培養(yǎng)基配方為:葡萄糖0.5%~5.0%，磷酸氫二鈉0.5 %~2.5 %，蛋白胨0.15 %~0.5 %，檸檬酸0.2 %~0.5 %，硫酸錳0.00045 %~0.0009%，硫酸亞鐵0.002%~0.02%，滅菌前NaOH調(diào)節(jié)pH值為6.5~7.5。

[0028]作為進(jìn)一步優(yōu)選方案，所述發(fā)酵過程中補(bǔ)入糖包括葡萄糖和液糖。

[0029]與現(xiàn)有工藝相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn):

[0030]1.本發(fā)明通過設(shè)計(jì)添加糖分布組件，使補(bǔ)入的糖能夠快速均勻分布到發(fā)酵液中，有效的解決了糖局部濃度過高造成發(fā)酵液滲透壓過大和產(chǎn)生“葡萄糖效應(yīng)”的問題，使整個(gè)過程不至于產(chǎn)生葡萄糖抑制和過多的副產(chǎn)物乙酸；同時(shí)也解決了發(fā)酵液中局部葡萄糖濃度過低而底物限制，使發(fā)酵液中的殘?zhí)茄杆俸谋M，導(dǎo)致菌種生產(chǎn)能力不能得到最大限度發(fā)揮的問題。

[0031]2.本發(fā)明采用葡萄糖測定儀對發(fā)酵液中的殘?zhí)沁M(jìn)行測定。該測定儀使用的是葡萄糖氧化酶膜，具有高度的專一性，提高了發(fā)酵液中殘?zhí)呛康臏?zhǔn)確性，更有利于發(fā)酵工藝的調(diào)整和控制。

[0032]3.在溶氧回升前，通過調(diào)整攪拌轉(zhuǎn)速或者空氣流量，將溶氧維持在較高的水平，溶解氧回升后按固定時(shí)間間隔調(diào)整攪拌轉(zhuǎn)速或者空氣流量，同時(shí)增加補(bǔ)糖速率，在發(fā)酵前期(O~12h)和發(fā)酵后期(13h~培養(yǎng)結(jié)束)將溶解氧控制在不同的水平，這一方面加快了菌種的生長速率，另一方面避免了工藝參數(shù)調(diào)整過快，糖補(bǔ)入量過多，造成發(fā)酵失控。

[0033]4.本發(fā)明與現(xiàn)有生產(chǎn)工藝相比不增加任何額外設(shè)備和人力投入的情況下，穩(wěn)定了種子罐的生長周期，延長了發(fā)酵罐的發(fā)酵周期，延長20h左右，降低了勞動(dòng)強(qiáng)度，大幅度的提高了發(fā)酵單位(4m3發(fā)酵罐:47g/L左右，36m3發(fā)酵罐36g/L左右)，降低了生產(chǎn)成本，整個(gè)工藝過程得到簡化，十分適合于工業(yè)化生產(chǎn)。

【專利附圖】

【附圖說明】:

[0034]圖1為本發(fā)明設(shè)計(jì)的L-色氨酸發(fā)酵補(bǔ)糖裝置示意圖，

[0035]圖中數(shù)字和字母所表示的相應(yīng)部件名稱:

[0036]1.發(fā)酵罐，2.糖輸送主管道，3.糖輸送分管道，4.糖輸送管道的蒸汽滅菌管道，

5.多孔分布管,6.出料孔,7.閥門,8.卡環(huán)(3.糖輸送分管道和5.多孔分布管構(gòu)成糖分布組件)

【具體實(shí)施方式】:

[0037]本發(fā)明實(shí)施例使用的工程菌為大腸桿菌菌株W3110trpEFBK，為利用市售菌株構(gòu)建的L-色氨酸生產(chǎn)菌，構(gòu)建方法詳見CN201110400855專利。

[0038]本發(fā)明實(shí)施例中使用的化學(xué)及生物試劑均為分析純或分析純級別以上。

[0039]實(shí)施例1[0040]種子培養(yǎng)基:葡萄糖5.0%，磷酸氫二鈉0.2 %，蛋白胨1.0 %，氯化鎂0.1 %，檸檬酸三鈉0.10%，硫酸亞鐵0.001%，硫酸錳0.0001%，以上均為重量百分比，滅菌前NaOH調(diào)節(jié)pH值為6.5。[0041 ] 發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖5.0%，磷酸氫二鈉0.5 %，蛋白胨0.5 %，檸檬酸0.2%，硫酸錳0.0009 %，硫酸亞鐵0.02%，以上均為重量百分比，滅菌前用NaOH將pH調(diào)至6.5，滅菌后用高濃度氨水將PH調(diào)至6.5。[0042]將菌種接入種子培養(yǎng)基中，接種量為0.1% v/v，在

罐溫33°C、pH6.5、罐壓0.06MPa和溶解氧60%以上的條件下于1000L的種子罐中培養(yǎng)16~17h，600nm吸光度值10~30時(shí)，按1.0% v/v的接種量接入4m3的發(fā)酵罐中，采用如下工藝進(jìn)行控制:罐溫33°C，罐壓0.06MPa，空氣流量1: 0.5vvm,攪拌轉(zhuǎn)速70rpm，在溶解氧回升前，調(diào)整攪拌轉(zhuǎn)速，每次提高12rpm，并且提高空氣流量，每次提高1: 0.25麗1，將溶氧控制在40%以上。溶解氧回升后按照固定時(shí)間間隔每次提聞12rpm的攬祥轉(zhuǎn)速，最聞轉(zhuǎn)速不超過180rpm,并且提聞空氣流量，最高不超過1: 1.5vvm，同時(shí)提高補(bǔ)糖速率，將溶解氧控制在40%~60%之間。自動(dòng)流加高濃度氨水將PH控制在6.5，通過流加葡萄糖含量為60~70%的糖，將殘?zhí)强刂圃?.1 %以下，發(fā)酵至42h結(jié)束。[0043]本實(shí)施例L-色氨酸的產(chǎn)量為29g/L。[0044]實(shí)施例2[0045]種子培養(yǎng)基:葡萄糖2.0%，磷酸氫二鈉0.2 %，蛋白胨1.0 %，氯化鎂0.1 %，檸檬酸三鈉0.10%，硫酸亞鐵0.001%，硫酸錳0.0001%，以上均為重量百分比，滅菌前NaOH調(diào)節(jié)pH值為7.5。[0046]發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖0.5 %，磷酸氫二鈉0.5 %，蛋白胨0.5 %，檸檬酸0.5%，硫酸錳0.0009 %，硫酸亞鐵0.02%，以上均為重量百分比，滅菌前用NaOH將pH調(diào)至7.5，滅菌后用高濃度氨水將PH調(diào)至7.5。

[0047]將菌種接入種子培養(yǎng)基中，接種量為5.0% v/v，在罐溫38°C、pH6.5、罐壓0.05MPa和溶解氧60%以上的條件下于1000L的種子罐中培養(yǎng)16~17h，600nm吸光度值10~30時(shí)，按15% v/v的接種量接入4m3的發(fā)酵罐中，采用如下工藝進(jìn)行控制:罐溫28°C，罐壓0.05MPa，空氣流量1: lvvm，攪拌轉(zhuǎn)速70rpm，在溶解氧回升前，調(diào)整攪拌轉(zhuǎn)速，每次提高12rpm，并且提高空氣流量，每次提高1: 0.25vvm，將溶氧控制在40%以上。溶解氧回升后按照固定時(shí)間間隔每次提高12rpm的攪拌轉(zhuǎn)速,最高轉(zhuǎn)速不超過220rpm,并且提高空氣流量，最高不超過1: 1.5vvm，同時(shí)提高補(bǔ)糖速率，將溶解氧控制在40%~60%之間。自動(dòng)流加高濃度氨水將PH控制在7.5，通過流加葡萄糖含量為60~70%的糖，將殘?zhí)强刂圃?.1 %以下，發(fā)酵至42h結(jié)束。[0048]本實(shí)施例L-色氨酸的產(chǎn)量為30g/L。[0049]實(shí)施例3[0050]種子培養(yǎng)基:葡萄糖2.5 %，磷酸氫二鈉1.5 %，蛋白胨0.5 %，氯化鎂0.5%，檸檬酸三鈉0.50%，硫酸亞鐵0.0001%，硫酸錳0.001%，以上均為重量百分比，滅菌前NaOH調(diào)節(jié)pH值為6.8。[0051]發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖5.0%，磷酸氫二鈉1.5%，蛋白胨0.15%，檸檬酸0.2%，硫酸錳0.00045 %，硫酸亞鐵0.002 %，以上均為重量百分比，滅菌前用NaOH將pH調(diào)至6.8，滅菌后用高濃度氨水將pH調(diào)至6.8。

[0052]將菌種接入種子培養(yǎng)基中，接種量為3.0% v/v，在罐溫30°C、pH6.8、罐壓0.04MPa和溶解氧60%以上的條件下于1000L的種子罐中培養(yǎng)16~17h，600nm吸光度值10~30時(shí)，按15% v/v的接種量接入4m3的發(fā)酵罐中，采用如下工藝進(jìn)行控制:罐溫30°C，罐壓

0.04MPa，空氣流量1: lvvm，攪拌轉(zhuǎn)速80rpm，在溶解氧回升前，調(diào)整攪拌轉(zhuǎn)速溶解氧回升后按照固定時(shí)間間隔每次提高12rpm的攪拌轉(zhuǎn)速,最高轉(zhuǎn)速不超過220rpm,并且提高空氣流量，最高不超過1: 1.5vvm，同時(shí)提高補(bǔ)糖速率，在O~12h時(shí)將溶解氧控制在40%~60%之間，在13h~培養(yǎng)結(jié)束將溶解氧控制在30%~50%之間，在發(fā)酵進(jìn)行到40h時(shí)降低動(dòng)力條件。自動(dòng)流加高濃度氨水將PH控制在6.8，通過糖分布組件流加葡萄糖含量為60~70 %的糖，將殘?zhí)强刂圃?.1 %以下，發(fā)酵至60h結(jié)束發(fā)酵。

[0053]本實(shí)施例L-色氨酸的產(chǎn)量為47g/L。

[0054]實(shí)施例4

[0055]種子培養(yǎng)基:葡萄糖3.0%，磷酸氫二鈉0.85%，蛋白胨0.1 %，氯化鎂1.0%，檸檬酸三鈉0.20%，硫酸亞鐵0.0005%，硫酸錳0.0007%，以上均為重量百分比，滅菌前NaOH調(diào)節(jié)pH值為7.0。

[0056]發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖2.0%，磷酸氫二鈉2.5 %，蛋白胨0.5 %，檸檬酸0.3%，硫酸錳0.0006 %，硫酸亞鐵0.01%，以上均為重量百分比，滅菌前用NaOH將pH調(diào)至7.0，滅菌后用高濃度氨水將PH調(diào)至7.0。

[0057]將菌種接入種子培養(yǎng)基中，接種量為5.0% v/v，在罐溫33°C、pH6.5、罐壓0.03MPa和溶解氧60%以上的條件下于2000L的種子罐中培養(yǎng)16~17h，600nm吸光度值10~30時(shí)，按20% v/v的接種量接入36m3的發(fā)酵罐中，采用如下工藝進(jìn)行控制:罐溫37°C，罐壓

`0.03MPa，空氣流量1: lvvm，攪拌轉(zhuǎn)速lOOrpm，在溶解氧回升前，通過調(diào)整攪拌轉(zhuǎn)速(每次提高IOrpm)和空氣流量(每次提高1: 0.15vvm)將溶氧控制在40~60%之間，溶解氧回升后按照固定時(shí)間間隔每次提高IOrpm的攪拌轉(zhuǎn)速(最高150rpm)或空氣流量(最高提高到1: 1.25vvm)，同時(shí)提高補(bǔ)糖速率，在O~12h時(shí)將溶解氧控制在40%~60%之間，在13h~培養(yǎng)結(jié)束將溶解氧控制在30%~50%之間，在發(fā)酵進(jìn)行到40h時(shí)降低動(dòng)力條件。自動(dòng)流加高濃度氨水將PH控制在7.0，通過糖分布組件流加葡萄糖含量為60~70%的糖，將殘?zhí)强刂圃?.1 %以下，發(fā)酵至60h結(jié)束。

[0058]本實(shí)施例L-色氨酸的產(chǎn)量為36g/L。

[0059]上面對本發(fā)明實(shí)施方式進(jìn)行了詳細(xì)說明，但是本發(fā)明并不限于上述實(shí)施方式，在本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所具備的知識(shí)范圍內(nèi)，還可以在不脫離本發(fā)明宗旨的前提下作出各種變化。

【權(quán)利要求】

1.一種高效發(fā)酵生產(chǎn)L-色氨酸的方法，包括種子培養(yǎng)和采用L-色氨酸發(fā)酵補(bǔ)糖裝置將補(bǔ)入糖均勻分布并進(jìn)行高效發(fā)酵培養(yǎng)的生產(chǎn)過程。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述生產(chǎn)L-色氨酸的方法，其特征在于:所述的種子培養(yǎng)過程包括如下步驟:配制種子培養(yǎng)基，將菌種接入種子培養(yǎng)基中，接種量為0.1~5.0%，在罐溫20~40°C，pH6.5~7.5，溶解氧60%以上于種子罐中培養(yǎng)至對數(shù)生長期的末期，600nm吸光度值10~30，制得種子液。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述生產(chǎn)L-色氨酸的方法，其特征在于所述種子培養(yǎng)基配方為:葡萄糖2.0~5.0%，磷酸氫二鈉0.2~1.5%，蛋白胨0.1~1.0%，氯化鎂0.1~1.0%，檸檬酸三鈉0.10~0.50%，硫酸亞鐵0.0001~0.001%，硫酸錳0.0001~0.001%，滅菌前NaOH調(diào)節(jié)pH值為6.5~7.5。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述生產(chǎn)L-色氨酸的方法，其特征在于，所述的采用L-色氨酸發(fā)酵補(bǔ)糖裝置將補(bǔ)入糖均勻分布并進(jìn)行高效發(fā)酵培養(yǎng)過程包括如下步驟: a)配制發(fā)酵培養(yǎng)基； b)將種子液以1.0~20% v/v的接種量接種發(fā)酵罐進(jìn)行發(fā)酵； c)發(fā)酵過程中通過調(diào)節(jié)發(fā)酵罐的攪拌轉(zhuǎn)速和空氣流量將溶解氧控制在一定的水平范圍； d)用氨水將pH自動(dòng)控制在6.5~7.5 ; e)流加葡萄糖含量為60~70%w/v的糖并采用糖分布組件，使補(bǔ)入的糖快速在發(fā)酵液中分布均勻，并將殘?zhí)强?/span>制在0.1%以下； f)全部發(fā)酵進(jìn)行到40~60h結(jié)束。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的生產(chǎn)L-色氨酸的方法，其特征在于:所述發(fā)酵過程中發(fā)酵罐培養(yǎng)溫度為20~40°C，罐壓0.02~0.06MPa,空氣流量1: 0.5~1: 1.5vvm,攪拌轉(zhuǎn)速70 ~lOOrpm。

6.根據(jù)根據(jù)權(quán)利要求4所述的生產(chǎn)L-色氨酸的方法，其特征在于:所述發(fā)酵過程中溶解氧控制方法為:在溶解氧回升前，通過調(diào)整攪拌轉(zhuǎn)速和空氣流量將溶氧控制在40%以上；溶解氧回升后按照固定的時(shí)間間隔以10~12rpm的速率提高攪拌轉(zhuǎn)速，或者提高空氣流量，但最高不超過1: 1.5vvm，同時(shí)提高補(bǔ)糖速率，從而使發(fā)酵罐O~12h溶解氧控制在40%~60%之間，13h~結(jié)束培養(yǎng)溶解氧控制在30%~50%之間。

7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的生產(chǎn)L-色氨酸的方法，其特征在于所述殘?zhí)强刂品椒?從發(fā)酵接種開始，每隔4h取樣，采用葡萄糖測定儀對發(fā)酵罐發(fā)酵過程中發(fā)酵液中的殘留葡萄糖進(jìn)行測定，根據(jù)測定結(jié)果確定合適的補(bǔ)糖速率，高于0.1 %則降低補(bǔ)糖速率，低于0.1%則增加補(bǔ)糖速率從而將發(fā)酵液中殘留葡萄糖控制在0.1% w/v以下。

8.為實(shí)施權(quán)利要求4所述生產(chǎn)L-色氨酸的方法而專門設(shè)計(jì)的一種L-色氨酸發(fā)酵補(bǔ)糖裝置，主要包括發(fā)酵罐本體、糖輸送主管道和至少一個(gè)糖分布組件，其中所述糖輸送主管道位于發(fā)酵罐本體上方，從外向內(nèi)穿入發(fā)酵罐本體內(nèi)；所述糖分布組件活動(dòng)連接在糖輸送主管道的末端，貫穿所述發(fā)酵罐本體內(nèi)部；所述糖分布組件主要由輸送分管道和其末端做成環(huán)形的多孔分布管構(gòu)成；所述輸送分管道上端活動(dòng)連接糖輸送主管道的末端；所述多孔分布管管體上和末端均設(shè)有出料孔，管體上出料孔呈不均勻分布，工作時(shí)糖會(huì)依次通過糖輸送主管道，輸送分管道，多孔分

布管的出料孔進(jìn)入發(fā)酵罐中，使糖在發(fā)酵罐中均勻分布

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的L-色氨酸發(fā)酵補(bǔ)糖裝置，其特征在于:所述多孔分布管上的出料孔的不均勻分布方式為距離糖輸送分管道越遠(yuǎn)，設(shè)置越密。

10.根據(jù)權(quán)利要求4所述的生產(chǎn)L-色氨酸的方法，其特征在于發(fā)酵罐培養(yǎng)基配方為:葡萄糖0.5%~5.0%，磷酸氫二鈉0.5%~2.5%，蛋白胨0.15%~0.5%，檸檬酸0.2%~0.5%,硫酸錳0.00045%~0.0009%，硫酸亞鐵0.002%~0.02%，滅菌前NaOH調(diào)節(jié)pH值為 6.5 ~7.5。

11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高效發(fā)酵生產(chǎn)L-色氨酸的方法，其特征在于:所述補(bǔ)入糖包括葡 萄 糖和液糖。

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產(chǎn)品信息
[顏色]	白色
[重量]	25g