色譜分辨和速度的基本原理
抖化學(xué) / 2022-09-22
色譜柱的設(shè)計(jì)
HPLC的核心是色譜柱。沒(méi)有一根在高線性流速下運(yùn)行時(shí)具有良好分辨力的柱子，則高壓泵、專門(mén)設(shè)計(jì)的注射器、高靈敏檢測(cè)器和梯度洗脫裝置的全部?jī)?yōu)點(diǎn)就都失去了意義。因此，對(duì)HPLC使用者特別重要的是了解在實(shí)用情況下決定儀器性能的主要因素。
分辨和速度的基本原理
色譜過(guò)程的目的都是分離一個(gè)混合物的組分，方法是把混合物樣品(最好是少量的)放置或注射在由分離材料(在LC中通常是細(xì)微顆粒)作成的色譜柱頭上，然后，以泵輸出的溶劑或洗脫液沖洗混合物通過(guò)柱子。在正確條件下，混合物的不同組分以不同的速度沿柱子遷移，并形成各別的譜帶，這些譜帶在遷移中互相分開(kāi)。譜帶在遷移中總要變寬，僅當(dāng)譜帶的展寬小于它們峰尖的距離時(shí)才能使組分分離成各別的譜帶。運(yùn)行正常的色譜，譜帶是對(duì)稱的(更專門(mén)地則稱為高斯分布; 44頁(yè)注1 )，下列關(guān)系適用于瞬間注射的兩個(gè)緊鄰的組分，它們沿柱子遷移的平均距離為Z(45頁(yè)注2):
譜帶的分離 ⊿z=z(⊿R/R)=z⊿k'/(1+k')
譜帶的底寬 ω=(16H)½ ∠z
式中⊿R是兩個(gè)譜帶的Rt值之差，4k'是它們的柱容量比之差，H 是常數(shù)，稱為“理論等板高度”，具有長(zhǎng)度的量綱。如后所示，可把它當(dāng)作柱內(nèi)部的動(dòng)態(tài)平衡的距離。
譜帶的分辨率Rs定義為
⊿z
Rs=------
ω
綜合方程(2-1)、(2-2)和( 2-3)可得
1 ⊿k' k' Z
Rs=---- --------- --------(-----)½
4 K， 1+k' H
比率( z/H )是長(zhǎng)度為z的柱所相當(dāng)?shù)睦碚撍鍞?shù)，這是以N表示的。k'的量值直接與溶質(zhì)在流動(dòng)相和固定相之間的平衡有關(guān)，因此與分配作用的標(biāo)準(zhǔn)自由能有關(guān)( 45頁(yè)注2 )。
分配比的相對(duì)差值⊿k'/k'可用(a- 1)/(1+a)來(lái)表示，式中a=k'2/k'1。
因此分辨率可表示如下
1 a-1 k'
RS=------(-------)(--------)N½
4 1+a 1+k'
↑ ↑ ↖
(a)相對(duì)分配值因子 (b)保留值因子 (C)柱效因子
變動(dòng)色譜參數(shù)N,k'和a對(duì)分辨本R,的影響
注:與方程(1-26)比較，兩式的差別在于這一推導(dǎo)采用了下k'。
三個(gè)因子強(qiáng)調(diào)了三種定性的概念。( a )化合物的分離要求在兩相之間具有不同的分配比(a≠1)。( b )要求分離的組分是被保留的(k'≠0)。( C )要達(dá)到分離就應(yīng)具有一定的柱效。
對(duì)于給出恰好分離的峰(Rs=1.5 )的典型例子，需要的條件是N=3600，k'=2，a=1.15。 一次改變一種參數(shù)至N=1600, k'=0.8和a =1.10時(shí)對(duì)分辨率的影響示于圖2-1。
分離速度
分離速度與沖洗速度密切相關(guān)，而后者又與柱的壓力降及顆粒大小有關(guān)。LC柱兩端的壓力降⊿p可用方程表示
φηLu
⊿p=------------
d2p
式中φ是有量綱的參數(shù)，稱作柱的阻抗因子;η是洗脫液粘度;L是柱長(zhǎng)，u是流體線速度(即L/tm,其中tm是不保留溶質(zhì)的通過(guò)時(shí)間); dp是顆粒直徑。柱的阻抗φ決定于顆粒的類(lèi)型及充填方式。其典型值列于表2-1。
柱的阻抗參數(shù)值表2-1
| |
干法充填 |
濕法充填 |
| 實(shí)心核球形顆粒(如薄殼材料) |
600~700 |
300~400 |
| 多孔微粒(碑片狀)(如硅膠類(lèi)) |
1000~2000 |
700~1500 |
| 多孔微粒(球形)(如硅膠類(lèi)) |
800~1200 |
500~700 |
曾經(jīng)常有爭(zhēng)論，快速現(xiàn)代LC需要高壓是因?yàn)椴捎昧思?xì)小的顆粒。檢驗(yàn)一下這種觀點(diǎn)是有啟發(fā)性的。假設(shè)有一長(zhǎng)度為L(zhǎng)的柱，顆粒直徑為dp。如果其余條件相同，則可假設(shè)h與dp無(wú)關(guān)。
(如后文所示，這是較粗略的近似，h與u無(wú)關(guān)，雖然在現(xiàn)代常用的條件下并不完全如此。)因而塔板數(shù)相同而粒徑不同的柱長(zhǎng)可方便地表示為L=Nhdp
式中h對(duì)于不同的dp大體是相等的。如果希望用這些不同的柱子得到相同的分析時(shí)間，就必須使u與L成比例，因而也與d成比例。事實(shí)上u=L/tm=Nhdp/tm
于是柱子兩端的壓力降是
φη( Nhdp)2
⊿p=-----------------
tmd²p
=φηN²h²/tm
這樣，洗脫時(shí)間tR=(1+k')tm峰的保留時(shí)間即
N²h²φη(1+k')
tn=------------------
⊿p
可見(jiàn)，對(duì)于一定的tm所要求的壓力降與dp無(wú)關(guān)，但與N2和h'成比例。這一結(jié)論很重要，因?yàn)樗赋隽耸褂眉?xì)的顆粒本身并不一定要采用高壓，也并非必須產(chǎn)生高速。實(shí)際上，LC 中液體的粘
度比GC中氣體的粘度大，是要求高壓的理由。細(xì)顆粒在恒定的⊿p下需要高速度的理由是頗為微妙的，但如后文所示，起因是在實(shí)際操作條件下，通常顆粒越細(xì)而h就越小。方程也表明在給
定壓力降和N而以分析速度來(lái)表示柱子性能的最好參量是h2φ。也即要獲得最優(yōu)性能要依靠同時(shí)減少流阻參數(shù)和換算塔板高度。因?yàn)楝F(xiàn)時(shí)的充填技術(shù)P難以改變兩倍以上，所以重要的是考慮影響h的主要因素，尤其是如何在實(shí)踐中選擇適當(dāng)操作條件以減小h。整個(gè)問(wèn)題的中心是塔板高度受洗脫速度所決定的方式。
.jpg "變動(dòng)色譜參數(shù)N,k'和a對(duì)分辨本R,的影響")
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