高效液相色相譜法基本定義和方程式
抖化學(xué) / 2022-09-14
一切形式的色譜都是分離混合物組分的方法，有賴于各種溶質(zhì)分子對(duì)于固定相和流動(dòng)相的相對(duì)親和性。
色譜方法是按照所使用的固定相和流動(dòng)相的類型和它們的存在狀態(tài)，以及支配分離的不同機(jī)理進(jìn)行分類的。例如，可分為薄，層色譜( T-LC); 氣相色譜(GC )及其次級(jí)區(qū)分氣一液色譜(GLC)和氣一固色譜(GSC);液一固(吸附)色譜(LSC);液一-液(分配)色譜( LLC )等等。此外，有三種可能的色譜展開(kāi)方式:前沿分析，頂替法和洗脫法。通常，HPLC是與洗脫展開(kāi)相聯(lián)系的，但在有些情況下，主要是梯度洗脫時(shí)，其中可能存在頂替的機(jī)理。
對(duì)經(jīng)典色譜分離的定性描述如下:
一支橫截面約為1厘米的玻璃柱以適當(dāng)?shù)奈絼┏涮畹剿姆种臐M度，將溶于適當(dāng)溶劑的樣品置于柱頂端使呈均勻的譜帶，然后以純?nèi)軇┰谥亓ψ饔孟率怪ㄟ^(guò)柱子。
在流動(dòng)相的作用下，最初的譜帶開(kāi)始沿柱子向下遷移，其中的組分開(kāi)始分離。僅受吸附劑微弱阻滯的組分，快速地通過(guò)固定床，阻滯越強(qiáng)的組分移動(dòng)越慢，如此，直至所有組分完全得到分離。
HPLC不過(guò)是上述技術(shù)的延伸，包括使用很細(xì)的、粒度分布窄的顆粒，由輸液泵產(chǎn)生的壓力而獲得的更高的流動(dòng)相速度，以及當(dāng)分離的組分流出色講桂時(shí)進(jìn)行指示的檢測(cè)系統(tǒng)。
以上清楚表明，溶質(zhì)譜帶以不同的速度遷移通過(guò)色譜床，而這種不同的遷移速度是各組分在固定相和流動(dòng)相之間平衡分配的函數(shù)。隨著講圖的展開(kāi)過(guò)程和組分的分離，與初始的諧帶相比，各譜帶也隨之而展寬了。各種因子對(duì)這一展 寬效應(yīng)都有影響，第2章對(duì)此將作詳細(xì)的討論。
在分配等溫線(見(jiàn)后面)是線性的情況下，分離譜帶的濃度分布是高斯型的，其變度與遷移距離z成比例。
σ2∞Z
比值因子σ2/z隨許多影響因素而變化，這些因素決定于柱的填充狀況和操作條件。此因子稱為“理論等板高度(HETP)”或塔板高度，這是Martin和Synge l1l在描述色譜分離過(guò)程時(shí)使用的名稱。
一個(gè)兩組分的典型分離示于圖1-1。在這個(gè)洗脫色譜圖上可得到重要的信息。
圖1-1提供可直接測(cè)量參數(shù)的典型洗脫色譜圖
柱色譜的一個(gè)基本保留參數(shù)，即任一組分的保留體積VR，可直接從測(cè)量該組分的保留時(shí)間tR的秒數(shù)，乘以用毫升/表示的體積流速而得到。于是VR1=tR1 Fo
式中，F(xiàn)o=體積流速，tR1一組分1的保留時(shí)間。同樣
tR2=tR2 Fo
圖1-1還有tm,這是不保留溶質(zhì)的保留時(shí)間，即一個(gè)在固定相中，完全不吸附或不溶解的溶質(zhì)，因此它與流動(dòng)相以同一速率流過(guò)柱子。其保留體積是
Vm=tmFo
這是柱中所含有流動(dòng)相總體積的一個(gè)量度;常稱為柱的“死體積”。
在以上所概括的簡(jiǎn)單模型中，樣品譜帶在流動(dòng)相的作用下，以流動(dòng)相速度的一個(gè)分?jǐn)?shù)流過(guò)色譜床。這一分?jǐn)?shù)稱為R，并可從下式求得一個(gè)化合物的R£值
樣品譜帶的移動(dòng)速率
R£=------------------------------------
溶劑前沿的移動(dòng)速率
參數(shù)R£是在干柱技術(shù)(如上所述)和TLC中測(cè)量得到的主要參數(shù)。
假定在溶質(zhì)流過(guò)色譜柱的運(yùn)動(dòng)過(guò)程中的某一一時(shí)刻流動(dòng)相停止了流動(dòng)，此時(shí)，樣品將在固定相和“停止的”流動(dòng)相之間平衡。這一情形描述于圖1-2,它表示了溶質(zhì)在固定相和“停止的”流動(dòng)相兩者中的濃度分布圖形。可看到，這兩個(gè)濃度分布圖除了大小可能不同而外，是完全相同的。
此時(shí)，濃度比等于分配比K，而
K=Cs/Cm
Cs、Cm分別為固定相和流動(dòng)相中的溶質(zhì)濃應(yīng)。
圖1-2溶質(zhì)在固定相和“停止的”流動(dòng)相中的平衡分配
獲得劉稱形請(qǐng)帶的一個(gè)條件是，分配系數(shù)隨樣品濃度呈線性變化，如這一條件沒(méi)有滿足，則譜帶將會(huì)歪斜，保留時(shí)間就要隨樣品濃度而變化(圖1-3)。
如果考察長(zhǎng)度為d㏄的一小段語(yǔ)帶(圖1-2)，則此小段中的溶質(zhì)在兩相中的濃度比稱為柱的容量比K'，它由下式與K相聯(lián)系
K'=qs/qm=Csasdx/Cmamd㏄
=Cmamd㏄
=Csas/Cmam=CsVs/CmVm
=K(Vs/Vm)
式中,as、am各為固定相與流動(dòng)相的平均橫截面積;Vs、Vm是柱中兩相的體積; qs、qm是長(zhǎng)度為d㏄的兩相中溶質(zhì)的量。K'在液相色譜中是個(gè)極重要的量，它將樣品在柱中的平衡分配與柱的熱力學(xué)性質(zhì)聯(lián)系起來(lái)。
一切平衡都是動(dòng)態(tài)的，在所述的模型中，在平衡時(shí)，溶質(zhì)分子在固定相和流動(dòng)相之間不斷地交換。
如果可能在一段時(shí)間中觀察一個(gè)溶質(zhì)分子，并跟蹤其路徑，就會(huì)發(fā)現(xiàn)這個(gè)分子在固定相中所停留的時(shí)間分?jǐn)?shù)，接近于在某一瞬間停留在固定相中的總的分子分?jǐn)?shù)，而經(jīng)過(guò)無(wú)限長(zhǎng)時(shí)間后，這兩個(gè)分?jǐn)?shù)在統(tǒng)計(jì)極限之內(nèi)是相等的。因此可以寫(xiě)作
分子在固定相中平 9s K'
--------------------------- = ----------- =----------
均停留的時(shí)間分?jǐn)?shù) 9m+9s 1 +K'.
同樣
分子在流動(dòng)相中平 9m 1
--------------------------- =------------ =-------
均停留的時(shí)間分?jǐn)?shù) 9m+qs 1+K’
顯然，這兩個(gè)分?jǐn)?shù)的和應(yīng)為1，因?yàn)榉肿颖厝皇遣辉诠潭ㄏ嘀芯驮诹鲃?dòng)相中。
如果流動(dòng)相重又開(kāi)始流動(dòng)，它以恒速u厘米/秒流過(guò)柱子，這會(huì)怎樣呢?當(dāng)溶質(zhì)分子從固定相進(jìn)入流動(dòng)相時(shí)，它也以速度u向前流動(dòng)，但當(dāng)它返回固定相時(shí)就保持靜止。于是，譜帶的平均順流速度將取決于流動(dòng)相的速度U，以及溶質(zhì)分子留在流動(dòng)相中的時(shí)間分?jǐn)?shù)。因此譜帶的速度U譜帶是
1 1
U譜帶=U（-----）=U[-------------------]
I+K 1+K(Vs/Vm)
前已定義R為譜帶相對(duì)于溶劑前沿運(yùn)動(dòng)的速率分?jǐn)?shù)，因此
1
R=-----
1+K'
或
1-R
K'=-----
R
由此可以看出，R是樣品在柱內(nèi)平衡分配的函數(shù)，并且因?yàn)橄疵撋V僅僅是干柱色講的推廣，這就可以將洗脫時(shí)間與這個(gè)最聯(lián)系起來(lái)。這樣，從圖1-1對(duì)于第一個(gè)溶質(zhì)就有U譜帶/U=tm/t1(tm=不吸附溶質(zhì)的洗脫時(shí)間，因此等于溶劑前沿通過(guò)整個(gè)柱子所需的時(shí)間。
但是
也就是說(shuō)，柱的容量比是洗脫一個(gè)溶質(zhì)譜帶較之洗脫個(gè)不保留的譜帶所多花的時(shí)間，除以不保留譜帶的洗脫時(shí)間。這些量值易于從洗脫譜圖上求得。K' 通過(guò)方程(1-6)與分配系數(shù)K相聯(lián)系，因?yàn)镵在線性洗脫色譜的條件下是一個(gè)常數(shù)，由此得出R也是常數(shù)。
分析這一情況可以看出，如果R值大，溶質(zhì)即快速地通過(guò)柱子。假如容質(zhì)的遷移速度U譜帶等于流動(dòng)相速度U乘以溶質(zhì)在流動(dòng)相中花費(fèi)的時(shí)間分?jǐn)?shù)R，就有
U譜帶情將=UR
當(dāng)R=0時(shí)，譜帶完全不遷移(U譜帶=0)，而當(dāng)R=1時(shí)，譜帶與流動(dòng)相以同一速度遷移，即U譜帶=U。這時(shí)U譜帶=L/tr,此處L=柱長(zhǎng)，U=L/tmO于是根據(jù)方程(1-14)
tM
tR=----
R
但是tR=VR/F0(方程1-3)和tm=Vm/F0(方程1-4)因此，
Vm
Vr=-----
R
從方程( 1-10 )可得
VR=Vm(1+K')
或從方程( 1-6 )
VR=Vm+KVs
方程( 1-18 )是色譜中的基本方程。它將組分的保留體積與柱的死體積及分配系數(shù)和所用固定相體積的乘積聯(lián)系起來(lái)。
本方程對(duì)于分配柱是正確的，但對(duì)于吸附柱則K要由A;(吸附劑的表面積)或W。(所用吸附劑的量)來(lái)代替。
因?yàn)閂m對(duì)于分離過(guò)程不發(fā)生作用，而且對(duì)混合物的所有組分都是恒定的，所以常常使用調(diào)整的或凈保留體積Vn;
Vn=VR-Vm= KVs
假如分離過(guò)程中同時(shí)有幾種獨(dú)立的保留機(jī)理在起作用，例如在離子交換色諧中，分離作用同時(shí)可伴有吸附和分配兩種效應(yīng)，因此最終的Vn是各別機(jī)理的各個(gè)V?的總和。
.jpg "圖1-1提供可直接測(cè)量參數(shù)的典型洗脫色譜圖")
.jpg "圖1-2溶質(zhì)在固定相和“停止的”流動(dòng)相中的平衡分配")
.jpg "分配等溫線的三種基本類型")
.jpg "公式")
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