色譜分離的原理及應用
化學試劑,九料化工商城 / 2020-11-26
色譜分離的原理及應用
色譜分離( chromatography)，過去亦稱色層分離，色是分析，很不統(tǒng)一、現在根據1975年科學出版社出版，“英漢化學
化工詞匯補編(分析化學部分)》所定的譯名，本節(jié)都用色分離這個名詞。
色譜分離是一種分離和鑒定化合物的有效方法.開始僅用于分離有色化合物，現已廣泛應用于無色化合物的分離和整定，按它的分離原理來說，大致可分為吸附色分高和分配色譜分離兩種。
吸附色譜分離主要是以氧化鋁、硅膠等為吸附劑，將一些物質自溶液中吸附到它的表面上，而后用溶液洗脫或展開.利用不同化合物受到吸附劑的不同吸附作用，和它們在溶劑中的不同溶解度，亦就是利用不同化合物在吸附劑和溶液之間分布情況不同而得到分離例如有甲和乙兩種化合物混在一起，當它們的溶液通過氧化鋁柱時，甲和乙都被吸附，溶劑向下流，這是第一步產生的現象吸附后，用極性稍大的溶劑沖洗氧化鋁柱時，溶劑即替代甲和乙的位置，被氧化鋁吸附甲和乙被溶劑溶解(亦即解吸)隨著溶劑自上而下移動、在移動過程中，甲和乙遇到新的氧化鋁時，又被吸附，溶劑繼續(xù)向下流如此反復進行，也就是甲和乙被氧化鋁吸附，被溶劑解，再吸附，再溶解……因此自上而下慢慢移動甲的親水性稍大，被氧化鋁吸附較強，在溶劑中溶解度較小，也就移動得慢一些乙的親脂性稍大一些，較難被氧化鋁吸附，在溶劑中溶解度稍大，也就移動得快一些，隨著溶劑的沖洗，二者分離，最后達到完全分離的地步如果繼續(xù)用溶劑沖洗，乙必定先被洗出來，而后甲被洗出來.多種化合物混在一起，它們的分離原理也是一樣，只是更復雜一些.吸附色譜分離可采用柱色譜和薄層色譜兩種方式。
分配色譜分離主要是利用混合物的組分在二種不相混溶的液體中分布情況不同而得到分離相當于一種連續(xù)性溶劑抽提方法.這樣的分離不經過吸附程序，僅由溶劑的抽提而完成固定在柱內的液體名為固定相，用做沖洗的液體叫做移動相.為了使固定相固定在柱內，需要一種固體如纖維素等來吸住它，稱為“載體”.載體本身沒有吸附能力，對分離不起什么作用，只是用來使固定相停留在柱內.進行分離時，也是先將含有固定相的載體裝在柱內，加入樣品溶液后，用適當的溶劑進行洗脫.在洗脫過程中，移動相和固定相發(fā)生接觸.由于樣品組份在二相之間的分配不同，因此被移動相帶著向下移動的速度也不同.易溶于移動相中的組份移動快一些，而在固定相中溶解度大的組分就移動慢一些，因此得到分離.分配色譜分離也可采用柱色譜和薄層色譜兩種方式.紙色譜也屬于分配色譜分離。
色譜分離在有機化學上的應用
(一)分離混合物:一些結構類似，理化性質相似的化合物混在一起，往往不是應用一般化學方法所能分離的，但應用色譜分離，有時可以達到有效分離的目的。
(二)精制提純化合物:有機化合物中含有少量結構類似的雜質，不易除去，也可利用色譜分離除去雜質，得到純品。
(三)鑒定化合物在一定的條件下，純粹的化合物在薄層色譜或紙色譜中都顯呈一定的移動距離，稱比移值或值(見144頁).所以利用色譜分離可以鑒定化合物的純度或確定兩種性質相似的化合物是否為同一化合物。
(四)觀察一些化學反應是否完成:在某些反應中，可以利用薄層色譜或紙色譜觀察原料色點的逐步消失，以證明反應的完成。
現在常用的色譜分離方法有柱色譜、薄層色譜和紙色譜等柱色譜主要用以分離混合物和精制化合物，薄層色譜和紙色譜主要用以分離和鑒定化合物，三者常需相輔進行.利用薄層色譜和紙色譜可以摸索柱色譜的分離條件.在柱色譜中也要利用薄層色譜和紙色譜以鑒定、分析和分段收集沖洗出來的溶液中的成分。
柱色譜
柱色譜(即柱層離、柱層析)包括以氧化鋁、硅膠等為吸附劑的吸附色譜分離和以纖維素等為載體的分配色譜分離.現在主要介紹以氧化鋁為吸附劑的柱色諳的操作方法。
(一)吸附劑:一般以氧化鋁為主.商品中有專供色譜用的活性氧化鋁.柱色譜用的氧化鋁以通過100－150目孔的粉末為.粉末太粗，溶液流出太快，分離效果不好;粉末太細，流出太慢，色譜用的氧化鋁通?？煞謮A性、中性及酸性三種。
堿性氧化鋁適用于碳氫化合物，生物堿以及其他中性化合物的分離.它的水提取液的pH值一般為9-10.氧化鋁水提取液p的測定，可取1克氧化鋁，加30毫升蒸水意沸10分鐘，冷卻，濾去氧化鋁后，測定濾液的pH值中性氧化鋁應用最廣，適用于醛、、以及酯等化合物的分離，它的水提取液的pH值為7、可取色用性化鋁，加2倍量的5％醋酸溶液煮沸10-20分鐘不時加以攪拌.放置后，傾去上層清液，再用水洗滌5、6次、最后在布氏漏斗上用水洗滌數次，盡量去除殘留的醋酸，抽、干燥、最后在高溫爐中活化。
酸性氧化鋁適用于有機酸類的分離，它的水提取液的pH值為4-4.5.可取氧化鋁，加入2N鹽酸溶液，使混合物呈剛果紅酸性反應傾去上層清液，用熱水洗至剛果紅試紙呈弱紫色，濾集后，干燥，加熱活化即成。
氧化鋁的活性分I-V五級一般用II一III級偶亦有用IV級的，I級的吸附作用太強，V級的吸附作用太弱，都不適用、關于活性的測定，現多用海氏( Hehmanek)法，在薄層板上進行活性測定.方法簡便，詳見薄層色譜項下。
吸附劑的活性和它的含水量有關.如將氧化鋁放在高溫爐(350－400℃)烘烤3小時，得無水物加入不同量的水分，即得不同程度活性的氧化鋁(見表2.6.1).例如欲制取III級氧化鋁，可在無水氧化鋁中加入6％水即成.為了使氧化中水分均勻，可先稱取無水氧化鋁940克，放在緊塞的圓底燒瓶中.另在一燒杯中，加入50毫升蒸餾水(略少于計算量)，逐漸加入燒瓶中的氧化鋁，攪拌均勻使不再有粘結現象，然后將此燒杯中的氧化鋁傾入圓底燒瓶中，振搖8小時，測定活性，得約級活性氧化鋁。
表2.6.1吸附劑的活性和含水量的關系
活性 I II III IV V
氧化鋁加水量，％ 0 3 6 10 15
硅膠加水量，％ 0 5 15 25 38
硅膠可同上法處理
（二）裝柱：裝置如圖2.6.1，玻璃管的大小和粗細，依要分離樣品的用量而定，一般來說，管的高度約為直徑的20一30倍.
先用洗液洗凈玻璃管，用水清洗后，用餾水清洗，干燥，在玻璃管底一層玻璃絲或脫脂棉，而后將氧化鋁裝入管裝入的方法分濕法和干法兩種.濕法是將備用的溶劑入內、而后將氧化鋁和溶劑調成漿狀，慢慢地倒入管中，應將管的下端活塞打開，使溶劑慢慢流出，吸附劑即漸漸沉干管底加完氧化鋁后，繼續(xù)使溶液流出，直至氧化鋁的沉降不再變動。
干法是在管上端放一漏斗，使氧化鋁均勻地經漏斗成一細流慢慢裝入管內，中間不應間斷.時時輕輕打玻璃管，使填裝均勻.全部加入后，加入溶劑，使氧化鋁全部潤濕。
一般以濕法裝柱為宜，因為容易把夾雜在氧化鋁中的氣泡趕出.無論采用那一種方法裝柱，必須注意：
1.不能使氧化鋁中有裂縫和氣泡，否則影響分離效果。
2.氧化鋁的高度一般為玻璃管高度的3/4.
3.裝好的氧化鋁柱上面覆蓋一層濾紙、玻璃絲或棉花，以保持氧化鋁上端頂部平整，不受流入溶劑的干擾、如果氧化鋁頂部不平，將來易產生不規(guī)則的色帶。
4.氧化鋁柱上面要覆一層溶劑，約0.5－1厘米高，勿使氧化鋁露出溶劑
圖2.61柱色譜裝置的液面，上面裝一分液斗。
5.分離1克樣品，需用氧化20－50克，依照樣品的性質而定。
(三)加樣:將要分離的樣品溶在一定體積的溶劑中配成樣品溶液將氧化鋁上的多余溶劑放出，直到柱內液體表面到達氧化鋁的表面時，停止放出溶劑，沿管壁加入樣品溶液，注意不讓溶劑把氧化鋁沖松浮起.樣品溶液加畢后，開放活塞，使液體漸漸放出，至溶劑液面和氧化鋁表面相齊(勿使氧化鋁表面干燥)，即準備用溶劑洗脫。溶
解樣品的溶劑要選擇適合：
1.溶劑要求較純如氯仿中含有乙醇、溶劑中的水分及不揮發(fā)物質等雜質，常會影響樣品的吸附和洗脫。
2.溶劑和氧化鋁不能起化學反應，如起了反應氧化鋁的組成受到破壞，即要失去吸附能力。
3.溶劑的極性應比樣品小一些，如果大了樣品不易被氧化鋁吸附。
4.溶劑對樣品的溶解度不能太大.如溶解度太大，易影響吸附.也不能太小，如太小，溶液體積增加，易使色譜分散。
5.常用的溶劑有石油醚、苯、乙醇、氯仿、乙等，沸點不宜過高，一般在4080C之間.有時也可用混合溶劑、如有的成分含有較多極性基團，在極性小的溶劑中的溶解度太小時，也可先選用極性較大的氯仿溶解，而后加入一定量的苯，這樣既降低了溶液的極性，又減少了溶液的體積。
(四)洗脫及分離:樣品吸附在氧化鋁柱上后，用合適的溶劑進行洗脫，這種溶劑稱為洗脫劑，如果原用的溶解樣品的溶劑沖洗柱后，不能達到分離的目的，可改用其他溶劑、一般極性較大的溶劑容易破壞樣品和氧化鋁之間的吸附現象.溶劑極性大，易將樣品洗脫下來，但又不易達到樣品中多組分分離的目的.因此常用一系列極性漸次增大的溶劑如石油、苯、乙醚、氯仿及甲醇等順次洗脫，為了逐步提高溶劑的洗脫能力，也可用混合溶劑作為過渡順次用石油、石油一苯、苯、苯乙醚、乙醚、乙醚一氯仿、氯仿一甲醇、甲醇等洗脫.品中各組分在氧化鋁上經過吸附，溶解，再吸附，再溶解規(guī)律地自上而下移動而互相分離.如果樣品各組分有顏色，在氧化鋁柱上的分離情況就能直接觀察出來.可以用洗劑洗脫后，分別收集各個成分.在多數情況下，化合物沒有色，那就要繼續(xù)洗脫，分段收集洗出的溶液利用下節(jié)所述的薄層色譜和紙色譜檢定每部分的成分.合并相同的部分，蒸去溶劑，即可得單一化合物。
在洗脫和分離的過程中，應注意下列幾點：
1.要繼續(xù)不斷地加入洗脫劑，并應保持一定高度的液面.在整個操作中應注意不使氧化鋁表面的溶液流干.一柱面溶液流干后，再加溶劑，易使氧化鋁柱中發(fā)生氣泡和裂縫，影響分離.
2.在收集洗脫劑時，多采用等份收集.每份洗脫劑的體積隨所用氧化鋁的量及樣品分離的具體情況而定.一般情，若用50克氧化鋁，每份洗脫劑的體積常為50毫升.如洗脫劑極性較大或樣品各組分的結構相近似時，每份的收集量要小。
3.應控制洗脫劑流出的速度，流速不應太快若流速太快，柱中交換來不及達到平衡，因而影響分離效果。
4.由于氧化鋁表面活性較大，有時會促使某些成分破壞，所以應盡量在短時間內完成一個柱色譜的分離，以免樣品在柱上停留時間過長，發(fā)生變化。
(五)氧化鋁的再生:將氧化鋁上端深色物質除去，用甲醇、稀醋酸、氫氧化鈉溶液及水洗滌，再經過高溫活化.檢查合格后，可以重復使用。
再生氧化鋁的檢查方法:取回收的氧化鋁約10克裝柱依次用50毫升石油醚、苯、乙醚、氯仿、甲醇等洗脫，分別干，如無殘渣，即可繼續(xù)使用。
對再生氧化鋁的活化，可適當延長高溫加熱時間，以促使氧化表面的有機物分解.一般來說，氧化鋁可重復使用多次.其次數依色譜過程中有機物污染的程度而定除了上述以氧化鋁為吸附劑的柱色譜外，也有用硅膠為
吸附劑、或用纖維素為載體的柱色譜.硅膠用于酸性及中性化合物的分離;纖維素主要用于分離極性較大的化合物，效果較好。
硅膠以通過100-160目或160目以上篩孔為宜，應用硅膠的柱色譜的操作方法和上述相同纖維素可從脫脂棉制取.取脫脂棉50克，剪成小塊，加入5％鹽酸600毫升，加熱煮沸3小時.放冷后，抽濾，用蒸餾水洗至中性，并且沒有氯離子為止.再用95％乙醇洗滌，使濾液沒有黃色為止干燥，磨細，通過80-120目篩孔，在105℃干燥2小時后備用.由于以纖維素為支持劑的柱色譜是屬于分配色譜分離，所以要先用固定相飽和，再用移動相處理，達到平衡后，再加入樣品溶液，進行分離。
薄膜塑料柱色譜
最近十年來，在一般柱色譜的基上，吸取薄層色譜的優(yōu)點，發(fā)展了薄膜塑料柱色譜.它的實驗方法是將吸附劑填裝在膜塑料(尼龍或聚乙烯)制的柱中，將要分離的混合物附著在柱的頂端，加展開劑，利用毛細管作用及重力作用，使溶劑慢慢向下移動，而將混合物展開.當溶劑達到柱的底部時，一般即完成了分離，用小刀沿著分離部位將柱子切開，從分段的吸附劑中，用溶劑提取所要的化合物。
此法的優(yōu)點是:(1)分離時間短，一般當溶劑到達柱的底都時，分離即完成(2)分離效果好，從薄層色譜上摸索到的條件，可以直接應用到薄膜塑料柱色譜上.(3)分離數量大，一根3.8×50厘米氧化鋁柱可以分離多至7-8克樣品，可以滿足實驗室一般研究需要(4)溶劑消耗少，不需用大量洗脫。
其缺點是對薄膜塑料有腐性的溶劑不能應用薄膜塑料柱色譜的實驗方法和一般柱色譜基本相同茲將其實驗要點簡介于后.
1.柱子的準備:一般可用薄膜塑料制成，這些薄膜必須具備下列條件:()堅固而容易切開，(2)不受一般溶劑腐(3)能透過紫外光線及(4)經濟價廉.尼龍及聚乙烯薄膜塑料能符合這些條件.這些塑料可以制成不同直徑的圓柱，按要可割成不同長度，其厚度以能耐壓和易切開為度，一般以0.05毫米為宜.分離一般化合物2克，可選用2.5×3厘米的柱子，對于難分離的混合物，可加大柱子的直徑和長度。
2.吸附劑:常用氧化鋁及硅膠為吸附劑.應用硅膠為吸附劑，柱子要加長一倍，因為硅膠的密度較氧化鋁大一倍.宜用活性較低的吸附劑，II-III較好.顆粒規(guī)格應較細，一般以200-300目較好氧化鋁的用量和待分離樣品的數量和難度有關分離一般混合物，每克樣品約需用氧化鋁70克對于難分離的混合物，每克樣品所需的氧化鋁可達300克。
8.裝柱:將適當長度的柱子的一端封閉(也可用繩子扎緊)，裝填一層玻璃棉，在柱子的底部(玻璃棉的下面)扎一些小孔。將吸附劑通過漏斗倒入柱內，裝至柱的1/8高度時，將柱子在硬的表面上敗擊幾次，使柱內吸附劑裝緊(如將樣品裝入熔點毛細管中一樣)，再裝至1/3高度，同樣處理裝緊最后裝至預定高度，裝好的柱子應很結實，能用夾子夾住。
由于薄膜塑料圓柱常以扁平型成卷保存，二側常有深的折痕，影響裝柱，一般可照下法裝柱;即將柱子一端封住或扎緊后，裝入一層玻璃棉，而后將柱子上端插入一段玻管，玻璃管有一淺溝，便于將薄膜塑料柱子扎住，通過橡皮塞將柱子放在一個大的玻璃套管中，經過玻璃套管的底部，輕輕抽氣，薄膜塑料柱子即展開.用一粗頸漏斗，加入吸附劑，邊加入邊用一平頭玻棒捶擊裝緊后，在柱子下端扎一些小孔，即可應用(圖2.6.2)。
4.上柱及展開:將樣品溶在少量低沸點的溶劑中，加入約5倍量的吸附劑，拌合后烘干，均勻地加在柱的上端，上面再覆蓋少量吸附劑和一層玻璃棉.加入展開劑，柱的頂端可保持有3-5厘米厚的液面，可用一個用橡皮塞塞住的分液漏斗控制。
所用的展開劑，可先在薄層色譜中用同樣目數的吸附劑摸索條件.所得的結果可以直接應用到柱子上去，也可先用一根1×20毫米的毛細管，上端有喇叭口，便于加料，下端用棉花塞住，用同樣的吸附劑摸索展開條件。
如能控制所需展開劑的用量，則分離時可不需看管，任其自動停止.一根2.5×50厘米的柱子，約需溶劑90毫升，50×50厘米的柱子約需600毫升.如果混合物很難分離，則可繼續(xù)滴加展開劑，使混合物繼續(xù)展開，這相當于延長柱子的長度，應盡量利用柱上的地位（九料化工http://f670.cn/）。
5.檢査和分離:有色混合物的分離，可按色帶用小刀將柱子切開，將各段吸附劑分別放在沙氏提取器中用溶劑提取，對于無色混合物，有的可在暗室中，經紫外線照射，發(fā)出螢光，據此定位分割，有的無色混合物不能產生螢光，則可在吸附劑中加入0.5％無機螢光粉，混合均勻后使用，根據螢光的消失來定位.最簡單的方法，可參考薄層色譜上的比移值(R∫)將柱子分割幾段而后用溶劑分別提取，用薄層色譜法鑒別合并相同部分，選取需要的化合物。
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