脂肪酶的結(jié)構(gòu)和作用機理
化學先生 / 2019-08-02
脂肪酶本身就是一個手性分子，近十年來，隨著生物化學和分子生物學技術的發(fā)展，對其活性中心結(jié)構(gòu)、作用機理等的了解日益深人，取得了令人矚目的進展。脂肪酶立體選擇性分子基礎的系統(tǒng)闡明，對脂肪酶在不對稱合成中的應用和基礎理論研究是十分必要的。
1：脂肪酶和酯酶的催化活性位點
到目前為止，已經(jīng)采用X射線衍射的方法對11種不同來源的脂肪酶和酯酶的結(jié)構(gòu)進行了研究，發(fā)現(xiàn)盡管它們的氨基酸序列和分子大小相差很大，但所有的脂肪酶和酯酶都以相同的方式進行折疊并具有相同的催化位點。通過對各種脂肪酶和酯酶的結(jié)構(gòu)相似性進行歸納，這種特有的折疊方式被命名為“a/β-水解酶折疊”(圖7-1)。
該結(jié)構(gòu)包含有一個被a~螺旋包圍著的，以平行β片層結(jié)構(gòu)為主的核。肽鏈通過這種折疊方式產(chǎn)生了一個絲氨酸組氨酸天門冬氨酸(或谷氨酸)三元催化位點，親核的絲氨酸位于平行β-片層和a螺旋之間的發(fā)夾結(jié)構(gòu)上，組氨酸和天門冬氨酸(或谷氨酸)位于絲氨酸的同一面，幾個氨基酸殘基位于絲氨酸的另一面，形成一個穩(wěn)定的氧陰離子孔洞 (圖7-2)。
不同來源的脂肪酶的結(jié)構(gòu)差異主要在于肽鏈形成的折疊環(huán)的數(shù)目和位置不同，如RML這樣的小分子脂肪酶，只由一個a螺旋形成覆蓋活性位點的蓋結(jié)構(gòu);而CRL這樣的大分子脂肪酶，卻由兩個a-螺旋形成覆蓋活性位點的蓋結(jié)構(gòu)。
2：脂肪酶的界面活化
脂肪酶和酯酶都能催化酯的水解，但只有脂肪酶可以催化水不溶性酯的水解。脂肪酶和酯酶的最大差別在于它們與底物的作用形式不同。酯酶的活性隨著底物濃度的增加而增大，表現(xiàn)為依賴于底物濃度的正常的MichaelisMenten活性，而脂肪酶在底物處于溶解狀態(tài)下幾乎沒有活性，只有當?shù)孜餄舛戎饾u增加到超出其溶解度極限時，才表現(xiàn)出活性的明顯增加，這種現(xiàn)象被稱為“界面活化”(圖7-3)。
“界面活化”現(xiàn)象的分子基礎被認為是酶分子的構(gòu)象變化所至，當缺乏油/水界面時，酶分子的活性位點被一個稱之為“蓋”的ar螺旋結(jié)構(gòu)覆蓋，穩(wěn)定氧陰離子的幾個氨基酸殘基的排列位置不正確，脂肪酶處于非活性構(gòu)象[Enz];當脂肪酶與兩相體系的油/水界面接觸時，覆蓋活性位點的ar螺旋結(jié)構(gòu)打開，暴露出活性位點，同時這種“蓋”的打開，也使穩(wěn)定氧陰離子的幾個氨基酸殘基位于正確的位置，脂肪酶處于活性構(gòu)象[Enz]≠(圖7-4)。
利用脂肪酶的“界面活化”特性，可制備出高活性的脂肪酶，如采用疏水性的有機溶劑對脂肪酶進行預處理或?qū)⒅久赣脧娛杷暂d體進行吸附，可以增大其在水溶液中的水解反應活性。C. Torres與A. Bastida等認為，這同樣是由于酶的分子構(gòu)象發(fā)生變化，覆蓋活性位點的ar螺旋結(jié)構(gòu)打開造成的。另外，脂肪酶的“界面活化”也為脂肪酶的分離純化提供了一種有效的分離純化方法。
3：脂肪酶的催化作用機理
脂肪酶催化水解反應的作用機理與絲氨酸蛋白水解酶的作用機理完全相同:酶先與酯結(jié)合形成一個四面體過渡態(tài)Tal,然后解離去醇后形成?；福；概c水分子結(jié)合形成另四面體過渡態(tài) Ta2，Tu2再解離為酶和酸完成一個催化循環(huán)。由于醇離去后形成?；福虼诵纬蒚a1的難易程度決定了酶對醇的選擇性:而Tal和Ta2中都包含有羧酸部分，因此形成Ta1和Ta2的難易都能決定酶對酸的選擇性(圖7-5)。
4：脂肪酶的選擇性及其分子基礎
脂肪酶的分子結(jié)構(gòu)研究表明，脂肪酶上的酯結(jié)合位點可以劃分為三個區(qū)城:位于β片層上方的ML區(qū);疏水腔;位于a-螺旋上方的隧道區(qū)。酯在催化位點上的排列方式為:醇部分結(jié)合于ML.區(qū)和疏水腔，酸部分結(jié)合于疏水腔和隧道區(qū)(圖7-6)。
醇部分ar碳上的中等大小取代基位于ML區(qū)，a-碳上的較大取代基位于疏水腔;對于酸結(jié)合部分，立體中心被認為是位于隧道口處，a-碳上的較大取代基位于隧道區(qū)，a-碳上的中等大小取代基位于疏水腔。羧酸部分簡單的結(jié)合模型如圖7-7所示。
由于不同脂肪酶的酸結(jié)合位點有差別，由此可以說明為什么不同脂肪酶對酸具有不同甚至相反的立體選擇性。不同的脂肪酶隧道區(qū)的長度差別很大，對于CRL,隧道區(qū)的長度可以容納至少18個碳原子的碳鏈，而RML和HLL的活性中心到酶分子表面的隧道區(qū)長度卻很短。因此不同的脂肪酶適用于不同大小的底物分子，Aspergillus sp.脂肪酶適用于較大分子的底物，而對較小分子底物的選擇性較差; Candida sp.脂肪酶適用于中等大小的底物;而Pseudo-monas sp.脂肪酶和Mucor sp.脂肪酶只適用于較小分子的底物，對大分子底物的選擇性較差。
5：底物結(jié)構(gòu)對脂肪酶催化反應速率的影響水西
2-芳基丙酸類藥物的底物結(jié)構(gòu)對反應速率的影響很大。對于底物結(jié)構(gòu)酸部分的影響，M.Arroyo等在水飽和異丁基甲基酮中采用固定化南極假絲酵母(Candida antarctica)脂肪酶催化五種2-芳基丙酸的不對稱酯化反應，反應活性順序為: (士)-酮洛芬>(土)-2-苯基丙酸>(士)-布洛芬>(士)-蔡普生=(士)-氟比洛芬。Sih 等采用游離的柱狀假絲酵母(Candida cylin-dracea)脂肪酶催化上述五種2-芳基丙酸甲酯和2-芳基丙酸乙酯的不對稱水解反應，也得到了同樣的反應活性順序(圖7-8)。
他們將這種反應話性的差歸結(jié)為脂防附成水膠對不同底物結(jié)合的難易程度不同。(士)-蔡普生和(士)-氟比洛芬分子芳基基團的構(gòu)象不利于其在流水座內(nèi)結(jié)合，而(土)翻洛芬、(土)2苯基丙酸和(土)布洛芬分子芳基團的構(gòu)象有利于其在疏水腔內(nèi)結(jié)合。
底物結(jié)構(gòu)的醇部分同樣對反應速率有影響，M. Aroyo等1國在水飽和異辛統(tǒng)中采用固定化南極假絲酵母脂肪酶(Candida amartia)催化(土)-2-苯基丙酸與醉的酯化反應，發(fā)現(xiàn)伯醉反應速率最快，仲醇次之，叔醇幾乎不反應J.M. Moreno等發(fā)現(xiàn)這主要是由于醇結(jié)合位點的寬度限制了仲醉和叔醇的結(jié)合.對于伯醇，短鏈的1-丙醇酯化速率要較1-辛醇和1-丁醇快。如果醇部分含有些拉電子基團， 如乙氧基、氨乙基、氰甲基等，由于其對酯鍵的活化，會明顯提高水解反應的速率。如Bttistel等采用蔡普生乙氧基乙酯作為底物，Tai 等采用布洛芬氯乙基等，都明顯提高了反應速率。
6：Candida rugosa 脂肪酶的同工酶
在許多微生物脂肪酶中，由于Candida rugosa脂肪酶具有高活性和立體選擇性，因此對其研究也較深人。該脂肪酶在世界各地有許多生產(chǎn)商，過去一直認為他們的產(chǎn)品是均一的，但S. Allenmark等發(fā)現(xiàn)，Candida rugosa脂肪酶是由許多催化效率和立體選擇性不同的同工酶組成的。在許多拆分反應中，這些同工酶的立體選擇性都差別很大甚至相反，催化活性和穩(wěn)定性差別也很大。R.C. Chang 等通過比較不同生產(chǎn)商提供的產(chǎn)品發(fā)現(xiàn)，同工酶各組分含量受培養(yǎng)條件、提純方法等影響，由此導致了不同產(chǎn)品在催化效率和立體選擇性上的差異。這大大限制了CRL在許多精細化學品合成中的應用，因此目前許多拆分反應都是采用生物化學純化法或有機溶劑處理轉(zhuǎn)化法獲取的純同工酶來進行的。
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