酶的固定化方法一一表面擔(dān)載法
化學(xué)先生 / 2019-08-03
表面擔(dān)載法是通過(guò)物理或化學(xué)過(guò)程,將酶擔(dān)載到非水溶性載體上的方法。它在固定化酶的制備中是使用最早的方法,有關(guān)這方面的報(bào)道也最多。
用這種方法制備固定化酶時(shí),必須按酶的種類(lèi)和性質(zhì),選擇合適的載體和固載方法。因?yàn)樗x用的載體種類(lèi)和固載方法對(duì)酶的擔(dān)載量和反應(yīng)性能影響很大。載體的化學(xué)組成、表面形貌、顆粒度、孔徑和孔結(jié)構(gòu)、表面積、親水性基團(tuán)等是主要考慮因素。一般而言,載體的親水性基團(tuán)越多,表面積越大,擔(dān)載的酶量就越高,所制得的固定化酶活性也就越高。
因?yàn)槊甘巧锎蠓肿樱ǔJ走x纖維素、葡聚糖、瓊脂糖、多糖類(lèi)街生物和聚丙烯酰胺凝膠等有機(jī)高分子載體,也可根據(jù)酶的性質(zhì)和固定化方法選擇合適的無(wú)機(jī)載體,如Al2O3、SiO2、TiO2、ZrO2和分子篩等,因?yàn)樗鼈兿鄬?duì)比較便宜,機(jī)械強(qiáng)度高,流體力學(xué)性質(zhì)好,使用中不容易溶脹(表8-1)。 根據(jù)結(jié)合形式不同,擔(dān)載法又可分為共價(jià)結(jié)合法、離子結(jié)合法及物理吸附法等三種。
(1)共價(jià)結(jié)合法共價(jià)結(jié)合法是指酶蛋白分子的功能團(tuán)和載體表面上的反應(yīng)基團(tuán)之間以共價(jià)鍵相互連接,形成固定化酶。常用載體包括天然高分子(纖維素、瓊脂糖、淀粉、葡萄糖凝膠、膠原及行生物等)、合成高聚物(尼龍、多聚氨基酸、乙烯-順丁烯二酸酐共聚物等)和無(wú)機(jī)載體(多孔玻璃、金屬氧化物等)。此法的優(yōu)點(diǎn)是酶與載體間連接牢固,即使用高底物濃度或離子強(qiáng)度的溶液進(jìn)行反應(yīng),也不會(huì)導(dǎo)致酶和載體分離。因此具有良好的穩(wěn)定性及重復(fù)使用性,成為目前研究最為活躍的一類(lèi)酶固定化方法。缺點(diǎn)是反應(yīng)條件的控制,要求比較苛刻。在反應(yīng)劇烈、操作復(fù)雜的條件下,常常會(huì)引起酶蛋白高級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,并導(dǎo)致活性中心受到破壞,從而難于保證制備的重復(fù)性,不是每次都能獲得高活力的固定化酶。
(2)離子結(jié)合法 此法是通過(guò)離子效應(yīng),將酶固定到具有離子交換基團(tuán)的非水溶性載體上。能用于離子結(jié)合法的載體,除具有離子交換基團(tuán)的多糖類(lèi)以外,聚電解質(zhì),如離子交換樹(shù)脂等合成高分子衍生物也可用作載體。離子結(jié)合法與前述的共價(jià)結(jié)合法比較,操作更加簡(jiǎn)便,處理?xiàng)l件比較溫和,而且酶的高級(jí)結(jié)構(gòu)和活性中心的氨基酸很少發(fā)生變性,因而可以得到較高活性的固定化酶。但這種方法與共價(jià)結(jié)合等化學(xué)方法比較,載體和酶的結(jié)合是依靠庫(kù)侖相互作用,因而不夠牢固,易受所使用的緩沖溶液限制和反應(yīng)溶液pH影響。在溶液離子強(qiáng)度較高的情況下,由于去屏蔽效應(yīng),會(huì)使酶從載體上脫落下來(lái)。
(3)物理吸附法這種方法是將酶蛋白通過(guò)范德華力等弱相互作用,吸附到不溶于水的載體表面上而使酶固定化。此法與前述的離子結(jié)合法比較,酶蛋白的活性中心不易受破壞,酶的高級(jí)結(jié)構(gòu)變化也不明顯,從載體對(duì)酶的適應(yīng)性來(lái)看,這個(gè)方法是好的,但其缺點(diǎn)是酶與載體的相互作用較弱,因而被吸附的酶極易從載體表面上脫落下來(lái)。其載體除活性炭、多孔玻璃、酸性白土、漂白土、高嶺土、礬土、硅膠、膨潤(rùn)土、氟基磷灰石、磷酸鈣凝膠等無(wú)機(jī)載體外,也可利用淀粉、谷蛋白這類(lèi)生物大分子。