固定化酶的催化活性
化學(xué)先生 / 2019-08-03
在水溶液中游離酶分子與底物同處于液相，外部環(huán)境兒乎相同，而酶被固定化以后，則處于載體的各向異性微環(huán)境中。由于載體物理化學(xué)性質(zhì)對(duì)酶與底物的作用和影響，從而可能引起酶的性質(zhì)發(fā)生變化。和游離酶比較，固定化酶性質(zhì)的改變，主要是由于酶處于載體的微環(huán)境中，會(huì)引起活性中心的氨基酸殘基、高級(jí)結(jié)構(gòu)和電荷狀態(tài)等發(fā)生變化。而載體對(duì)固定化酶性質(zhì)的影響，則主要表現(xiàn)在固定化酶周?chē)?，?huì)產(chǎn)生立體和擴(kuò)散效應(yīng)，影響反應(yīng)中酶和底物分子的接觸。根據(jù)大量的實(shí)驗(yàn)觀察證明，可歸納為空間效應(yīng)、分隔效應(yīng)和擴(kuò)散效應(yīng)。
(1)空間效應(yīng)載體的存在會(huì)對(duì)酶的活性部位或調(diào)節(jié)部位起掩蔽作用，造成空間位阻，影響酶的活性中心與底物的接觸，從而降低固定化酶的反應(yīng)活性(圖8-2)。對(duì)于大分子底物，空間效應(yīng)的影響比較明顯;而小分子底物，由于容易克服載體造成的立體障礙，與酶的活性中心進(jìn)行反應(yīng)，空間效應(yīng)則不明顯，對(duì)固定化酶活力的影響不大。為了提高酶分子的空間自由度，使固定化酶適應(yīng)較大分子底物的催化反應(yīng)，可以加長(zhǎng)載體與酶之間橋接的分子鏈長(zhǎng)度，但只有采用有機(jī)載體和共價(jià)鍵結(jié)合的固定化方法才能做到這一點(diǎn)。 在用包埋法進(jìn)行酶的固定化時(shí)，因?yàn)槊副桓叻肿游镔|(zhì)的半透膜所包圍，也會(huì)影響大分子底物與酶之間的相互作用，對(duì)于小分子底物的影響則較小，也應(yīng)屬于空間效應(yīng)。
(2)分隔效應(yīng)在固定 化酶催化反應(yīng)過(guò)程中，即使酶的分子不發(fā)生變形，由于反應(yīng)體系從均相轉(zhuǎn)變?yōu)槎嘞啵矔?huì)使固定化酶和反應(yīng)液之間產(chǎn)生各種組分，如氫離子、底物、產(chǎn)物、抑制劑、活化劑和輔酶等濃度梯度的變化。這種變化對(duì)固定化酶活性的影響稱(chēng)為分隔效應(yīng)。分隔效應(yīng)反映了固定化酶所處的微環(huán)境對(duì)其反應(yīng)活性的影響，早在20世紀(jì)70年代初就有人對(duì)這種現(xiàn)象進(jìn)行了理論分析。當(dāng)固定化酶載體表面帶有負(fù)電荷時(shí)，由于靜電吸引作用，靠近固定化酶表面的氫離子濃度會(huì)比溶液中高。也就是說(shuō)，固定化酶所處微環(huán)境中的pH要低于液相，這樣實(shí)測(cè)的反應(yīng)最佳pH將向堿性區(qū)移動(dòng)。反之，固定化酶載體表面若帶有正電荷，則會(huì)對(duì)溶液中的氫離子產(chǎn)生排斥作用，使實(shí)測(cè)反應(yīng)液的pH偏低。帶電固定化酶載體表面與周?chē)芤褐g的pH差值可用下式表示:
△ pH=0.43e/ψκΤ
式中，e為電子電荷; ψ為固定 化酶的表面電勢(shì); k為玻爾茲曼常數(shù): T為熱力學(xué)溫度。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，分隔效應(yīng)引起的固定化酶反應(yīng)最佳pH的變化，最高可達(dá)3個(gè)單位。
帶電載體固定 化酶與帶電底物、抑制劑和其它組分之間的相互作用,也可以同樣進(jìn)行定性和定量的理論解釋。固定化酶反應(yīng)體系中組分濃度分布的不均勻性，除靜電作用以外，還表現(xiàn)為親水性和疏水性等其它形式。加強(qiáng)攪拌可以抑制分隔效應(yīng)造成的不利影響。
(3)擴(kuò)散效應(yīng)光酶的固定化使生物催化反應(yīng)從均相轉(zhuǎn)化為多相過(guò)程，這樣就產(chǎn)生了反應(yīng)底物從液相向固定化酶表面?zhèn)鬟f時(shí)產(chǎn)生的擴(kuò)散阻力。多相化學(xué)催化反應(yīng)過(guò)程中的經(jīng)典傳質(zhì)理論，同樣也適用于固定化酶催化反應(yīng)過(guò)程。擴(kuò)散阻力也可以分為外擴(kuò)散和內(nèi)擴(kuò)散兩種，外擴(kuò)散是反應(yīng)底物從溶液向固定化酶表面擴(kuò)散時(shí)，穿過(guò)水相和固定化酶之間的邊界層產(chǎn)生的，也稱(chēng)為液膜擴(kuò)散阻力;內(nèi)擴(kuò)散是底物分子到達(dá)固定化酶表面后，向結(jié)合有酶分子的載體內(nèi)孔擴(kuò)散產(chǎn)生的阻力(圖8-3)。 擴(kuò)散效應(yīng)可以通過(guò)選擇適宜固定化載體的形狀、減小粒子尺寸、提高底物濃度、強(qiáng)化攪拌或增加流速等加以改善或消除。
擴(kuò)散效應(yīng)在個(gè)別情況下也可以給酶催化反應(yīng)帶來(lái)好處，例如，在多酶共固定化的反應(yīng)體系中，當(dāng)反應(yīng)為:A→B→C→....→Z時(shí).如果中間產(chǎn)物在載體內(nèi)部的擴(kuò)散速率減慢，將有利于提高生成最終產(chǎn)物2的總包反應(yīng)速事。
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