751型紫外分光光度法測(cè)定維生素B12含量
實(shí)驗(yàn)室k / 2019-07-19
一、目的
1.了解751型可見——紫外分光光度計(jì)的使用方法。
2.熟悉近紫外區(qū)波長(zhǎng)的選擇和測(cè)定含量的方法。
二、維生素B12的測(cè)定原理
維生素B12是含有鈷的內(nèi)絡(luò)鹽的有機(jī)化合物(C63H88O14N14PCo＝1355.38)，為深紅色結(jié)晶或結(jié)晶性粉末，其注射液常為每1毫升含0.05mg、0.1mg、0.25mg、0.50mg和1.0mg維生素B12的安瓿劑型，在278±1nm、361±1nm與550±2nm波長(zhǎng)處有最大吸收。前兩個(gè)屬紫外區(qū)，后者為可見光區(qū)的最大吸收波長(zhǎng)，這三個(gè)λ最大都可用來(lái)測(cè)定本品。藥典規(guī)定用λ最大＝361±1nm的波長(zhǎng)處測(cè)定本品的吸收度A值，此波長(zhǎng)下的比吸光系數(shù)E1cm·361 1%＝207。361nm屬近紫外區(qū)波長(zhǎng)，要用751分光光度計(jì)的紫外系統(tǒng)，其具體測(cè)定方法與有色物質(zhì)測(cè)定方法相同。一般也應(yīng)首先繪制吸收光譜曲線和測(cè)求λ最大，但本實(shí)驗(yàn)已規(guī)定在最大吸收波長(zhǎng)λ最大＝361nm下直接對(duì)本品溶液進(jìn)行測(cè)定，所以只要儀器已經(jīng)校正，可在361nm波長(zhǎng)處直接測(cè)定，不必再做吸收光譜曲線的繪制和λ最大的測(cè)定。
三、操作步驟
1.維生素B12樣品比色液的制備 精密吸取B12注射液若干毫升(V)(要按注射液標(biāo)示濃度而定)，加水準(zhǔn)確稀釋至幾倍，即配制成每毫升含B12樣品重為25～30微克的比色液。
如設(shè)V＝精取B12注射液樣品的體積；V1＝稀釋以后的體積；假如現(xiàn)有安瓿型B12注射液，其標(biāo)示濃度為0.50(毫克/毫升)，所配成稀釋后的比色液濃度為25(微克/毫升)，則
V×0.50(毫克/毫升)＝V1×25(微克/毫升)
因V1＞V，故n＝V1/V＝稀釋倍數(shù)＝0.5×1000/25＝20(倍)
例如，精密吸取濃度為0.50(毫克/毫升)的B12注射液5.00毫升于100毫升容量瓶中，小心加蒸餾水至刻線，充分搖勻。其稀釋倍數(shù)即為20倍。稀釋后的濃度為0.50×5.00/100＝0.025(毫克/毫升)＝25(微克/毫升)，即C樣＝25(μg/ml)。
2.在751分光光度計(jì)上測(cè)定吸收度A值
(1)檢查儀器各部件、接線及電源電壓等。
(2)備好空白液、樣品液等比色液，選用石英比色杯。
(3)所有部件的開關(guān)都放在“關(guān)”或“O”位上。
(4)將暗電流調(diào)節(jié)器閘門(15)放在“關(guān)”的位置，即將光門拉桿推入，使光路遮斷。
(5)靈敏度鈕(22)先逆時(shí)針?lè)较蜣D(zhuǎn)到底后再順時(shí)針轉(zhuǎn)三圈左右。
(6)從儀器的光源燈室(7)、比色杯暗室(11)及光電管室(13)中取出干燥劑袋保存于干燥器內(nèi)。
(7)將波長(zhǎng)選擇鈕(16)旋至361±1nm處。
(8)將光電管拉桿(14)推入即為紫敏光電管處于光路承受端。
(9)狹縫寬度(20、19)調(diào)至0.05～0.10nm范圍。
(10)將光源選擇柄手(7的背部)板至氫燈位置，即凹面聚光鏡處于氫燈的光路系統(tǒng)。
(11)開啟附加的電子穩(wěn)壓器(220伏輸入與輸出)，再開啟氫燈開關(guān)(4)(如無(wú)附加的電子穩(wěn)壓器則直接開啟氫燈開關(guān))，各指示燈亮后注視穩(wěn)壓器電表，調(diào)電壓在220伏處，并開啟放大器電源(1)(與鎢燈同一個(gè)總開關(guān))。如果開啟氫燈開關(guān)后數(shù)秒鐘內(nèi)氫燈的藍(lán)色指示燈不亮?xí)r，說(shuō)明氫燈未亮，可再按下圓鈕即可增高啟動(dòng)電壓，當(dāng)藍(lán)色指示燈亮后說(shuō)明氫燈已亮。
(12)選擇鈕(21)撥至“校正”擋如指針偏向一側(cè)，立即調(diào)節(jié)“暗電流”鈕，使指針約指“O”處，儀器預(yù)熱20分鐘。
(13)將空白比色液推入光路上.
(14)再節(jié)暗電流鈕(23)使指零電表指針指“0”處。為使測(cè)定中操作準(zhǔn)確，則須經(jīng)常檢查光路切斷情況下電表指針指零?；蛎看螠y(cè)定時(shí)分別用暗電流鈕校正指零。
(15)調(diào)節(jié)A、T讀數(shù)盤(17)至T＝100％。
(16)選擇開關(guān)鈕(21)調(diào)到“×1”擋上。
(17)拉開光門(15)(即暗電流閘門)，光路接通，使單色光經(jīng)空比色杯后射入光電管。
(18)調(diào)節(jié)狹縫調(diào)節(jié)鈕使指零電表的指針大致指在零附近(相當(dāng)于粗調(diào)節(jié))，再調(diào)節(jié)靈敏度旋鈕準(zhǔn)確調(diào)至“零”位(相當(dāng)于細(xì)調(diào)節(jié))。此時(shí)不論推入還是拉出光門(暗電流閘門)，指零電表都應(yīng)指零，否則應(yīng)再如上重復(fù)調(diào)節(jié)。此時(shí)已相當(dāng)于T＝100％。
(19)再將待測(cè)樣品比色液推入光路。因其吸收度較空白液大，光電流減小，指針向右偏移。再輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)吸收度A讀數(shù)盤鈕(17)使指零電表指針重新指“零”位，從讀數(shù)盤上可直接讀出待測(cè)樣品液的吸收度A或T值來(lái)。如有其它被測(cè)液可按上述同樣操作求出A或T值。
(20)實(shí)驗(yàn)中須按前述步驟嚴(yán)格操作。實(shí)驗(yàn)完畢后要關(guān)閉選擇開關(guān)(21)、氫燈電源穩(wěn)壓器(4)和鎢燈及放大器電源穩(wěn)壓器及附加交流電子管穩(wěn)壓器的開關(guān)。狹縫調(diào)節(jié)鈕(20)轉(zhuǎn)至0.01刻度處；波長(zhǎng)選擇鈕(16)轉(zhuǎn)至625nm處；A、T旋轉(zhuǎn)(17)轉(zhuǎn)至100％處；洗凈比色杯放入盒中拔下電源插頭；干燥劑袋放回原處；待儀器降溫后用罩罩好；填寫使用登記。整理好記錄。
3.原維生素B12樣品液百分含量及濃度計(jì)算
假設(shè)已知稀釋樣品液濃度C樣＝25μg/ml＝0.0025％(g/ml)，測(cè)得A樣＝0.50，則
則每1毫升原注射液中純V·B12的毫克數(shù)＝每1毫升注射液的標(biāo)示重×V·B12％。
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