馬肝脫氫酶的純化
抖化學 / 2022-11-17
馬肝脫氫酶的純化目的 為說明親和色譜 法可以有效地用于復雜分子的特異分離。
設備 實驗室常規(guī)設備，必須洗滌清潔。凝膠電泳設備。本實驗的設備由Pharmacia(G.B)有限公司提供(包括Pha-rmacia的電泳儀GE-4的說明)。
材料 樣品:S'-AMP-Sepharose 4B 0.5克;馬肝提取液3毫升;蔗糖;商品ADH0.1毫升(含量5毫克/毫升)。緩沖液: (1)0.1M, pH7 .5磷酸鈉緩沖液+1mM谷胱甘肽100毫升; (2)0.1M, pH7 .5磷酸鈉緩沖液+ 1mM谷胱甘肽+0.05mMNAD*50毫升;(3)0.1M, pH7 .5磷酸鈉緩沖液+1m M谷胱甘肽+0.05m MNAD+ +1.1 m M吡唑20毫升。P .A.A梯度凝膠; 1%酰胺黑，溶于50毫升7%醋酸中; 0.1M甘氨酸pH10 2.5升; 7%醋酸( V/V ) 1升。
操作步驟 1.凝膠的制備。在盛有0.5克冷凍于燥的5'-AMP Sepharose 4B的瓶中充滿緩沖液(1);轉動5分鐘。向根短柱(100×0.5毫米)中加一些緩沖液(1) (約至10毫米深)，堵住出口。向柱中倒入上述凝膠懸浮液，使其沉降。插入聯(lián)接的塞子直到剛好在凝膠的表面之上。打開出口用50毫升緩沖液(1)以最高流速沖洗(使凝膠在環(huán)境壓力流下填充得緊密)，然后，使柱頭接頭落到凝膠表面的頂端。棄去流出液。
2.加入馬肝粗提取液。用巴斯德移液管吸取2毫升馬肝粗提取液加到柱的頂部，用100毫升量 簡收集流出液。當樣品通過柱子時，使流速減至最低(使之有一定的反應時間，以使脫氫酶與基質(zhì)結合)。用緩沖液(1)沖洗。
3.非特異性吸附蛋白質(zhì)的洗脫。當收集的洗脫液總量達5毫升時，使流速增至最大值(將色譜柱下端的活塞完全打開)，用40毫升緩沖液(1)沖洗。在這階段開始準備電泳儀(見第6條)。轉變至緩沖液(2)，以最大流速沖洗40毫升。
4.ADH的特異頂替。轉到最低流速;用緩沖液(3)洗脫ADH,用10毫 升的量簡收集流出液。棄去最初的4毫升，收集3毫升純的ADH。立即開始進行濃縮。
5.洗脫的ADH的濃縮。用塑料注射器將洗脫液轉移到Mini-con濃縮器中，濃縮10倍。濃縮液轉移入小管。
6.用聚丙烯酰胺凝膠梯度電泳法，鑒定 制備的ADH及測定共純度。電泳設備按照標準方法組裝(見Pharmacia儀器手冊GE-4,第4頁，步驟3-22,或其它設備的適宜的組裝步驟)。
向三個樣品管分別加入馬肝粗提取液，制備的濃縮ADH溶液和市售的ADH(用作比較)。加入蔗糖以使樣品液的比重大于電泳緩沖液。
加樣及電泳試驗(詳見Pharmacia GE-4說明第6頁，或其它電泳儀說明的適當部分)。用Hamilton微量注射器將各10微升上述三種樣品加至電泳儀的放樣品部位。進行電泳。
試驗完畢，取出凝膠在培養(yǎng)皿( Petri dish )中染色(詳見Pharmacia GE4說明第6頁，或其它適當資料)。
結果 馬肝醇脫 氫酶的親和色譜法純化結果示于圖1355。圖中上面部分描記的是粗提取液，中部是本實驗制備的純ADH,下部是市售的ADH。
結論 雖然這一實驗 所涉及的工作相當復雜，但實際并非如此。結果表明(圖13- 55)本技術能夠從復雜的生物混合物中制備出純樣品，比市售的純度更高。
但須指出，親和色譜法的最后成功，將取決于實驗人員的技能，即是否把適當?shù)呐湮惑w結合于適當?shù)幕w上，以使活性部位可與所需純化的組分發(fā)生相互作用。
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